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Biology

Síntesis y caracterización de nanosondas fosforescentes de imágenes de oxígeno en sistemas biológicos

doi: 10.3791/1731 Published: March 3, 2010

Summary

Se presentan los principios de la medición de oxígeno por temple fosforescencia y revisión del diseño de la porfirina basada en nanosensores dendríticas para obtener imágenes de oxígeno en los sistemas biológicos.

Abstract

La medición de oxígeno por temple fosforescencia [1, 2] se compone de los siguientes pasos: 1) la sonda se introduce en el medio de interés (por ejemplo la sangre o el líquido intersticial), 2) el objeto está iluminado con luz de longitud de onda adecuada para excitar la sonda en su estado triplete, 3) la fosforescencia emitida se recoge, y su evolución en el tiempo se analiza para obtener el tiempo de vida fosforescencia, que se convierte en la concentración de oxígeno (o presión parcial, pO

Protocol

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1. Descripción general del protocolo de medición de oxígeno

(Esta sección no tiene ningún tipo de acción, pero es crucial para entender el resto del documento. Puede ser filmado, por ejemplo, como una secuencia de diapositivas de un Punto de unos pocos de energía, acompañado por la voz.)

1.1) La sonda se introduce en el medio de interés, por ejemplo, se inyecta en la sangre o los líquidos intersticiales de un animal.

1.2) El objeto (la superficie de los tejidos) se ilumina con la luz de longitud de onda apropiada con el fin de promover la investigación sobre su estado excitado triplete. Normalmente, la excitación se produce a través del mecanismo de un fotón. Sin embargo, en el caso de la especial de dos fotones mayor sondas, la excitación se puede hacer a través del mecanismo de dos fotones, lo que permite el uso de las sondas en las aplicaciones de la microscopía de alta resolución. De un fotón de excitación general, ofrece una resolución espacial de menos, pero requiere más simple de instrumentación y se puede utilizar en un solo punto de medición con LED de fibra óptica basada phosphorometers.

1.3) La fosforescencia emitida por la sonda se origina en el estado triplete de larga vida. La molécula de la sonda debe estar especialmente diseñados para dar un alto rendimiento cuántico del estado triplete y emiten fosforescencia en lugar de la fluorescencia. Mientras que en el estado triplete, la sonda puede experimentar encuentros colisión con las moléculas de oxígeno, que puede desactivar el estado de triplete - ". Temple" de un proceso llamado En ausencia de oxígeno, la vida útil del estado triplete, y por lo tanto de la decadencia de la fosforescencia, es τ 0. En presencia de oxígeno, la vida fosforescencia (τ) se reduce como consecuencia de la extinción. Existe una relación directa entre el tiempo de vida del estado triplete y la cantidad de oxígeno en el ambiente. Esta es la bien conocida relación de Stern-Volmer, que conecta la vida (τ) de la fosforescencia de la concentración de oxígeno [O 2] (o la presión parcial de oxígeno PO 2):

ecuación

En los sistemas biológicos, el oxígeno es de lejos el extintor más efectivo de la fosforescencia, que hace que el método de enfriamiento fosforescencia muy selectiva al oxígeno.

1.4) Con el fin de medir el tiempo de vida t, los fotones emitidos fosforescente se han agrupado en el tiempo. Por ejemplo, después del impulso de excitación, 200 fotones pueden ser recogidos en los primeros 15 microsegundos, 150 fotones recogidos en los próximos 15 microsegundos, y así sucesivamente, hasta que no se recogen los fotones. Los números de los contenedores en función del tiempo dará la decadencia fosforescencia, que se analiza para obtener el tiempo de vida τ. En las imágenes, este procedimiento se aplica en cada pixel de la imagen, dando lugar a mapas de toda la vida fosforescencia. Las mediciones de tiempos de vida no son sensibles a la heterogeneidad de la distribución de la sonda a través del objeto, que es común para las muestras biológicas. Por lo tanto, las vidas único informe sobre el oxígeno. Τ vidas se convierten en las concentraciones de oxígeno mediante la relación de Stern-Volmer.

2. La construcción de sondas fosforescente

Sondas fosforescente para mediciones de oxígeno en los sistemas biológicos consisten en cromóforos fosforescente (núcleos), encapsulado en jaulas construidas de dendrímeros - polímeros hiper muy regular [3]. Dendrímeros proteger a los núcleos de las interacciones con el medio ambiente y el control de la velocidad de difusión de oxígeno a los núcleos, lo que permite optimizar la sensibilidad y el rango dinámico de las sondas (q constante k en la relación de Stern-Volmer). Las terminales de los dendrímeros son modificados con polietilenglicol químicamente inerte hidrofílico (PEG) los grupos, por lo que las sondas altamente soluble en agua y la prevención de su interacción con macromoléculas biológicas.

Núcleos fosforescentes de las sondas se Pt o Pd complejos de porfirinas y las porfirinas π extendida. π-extendido porfirinas son las porfirinas en el que los anillos de pirrol se funden con fragmentos aromáticos externo. π-extensión permite el ajuste de las propiedades espectroscópicas de las sondas para satisfacer las necesidades de una aplicación de imagen en particular (por ejemplo, frente a la microscopía tomografía). A modo de ejemplo, se describe la síntesis de tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (PDAR 4 TBP) [4]. PDAR 4 TBP tienen bandas de absorción de gran alcance en el extremo rojo del espectro de la fosforescencia y fuerte, muy adecuado para la medición bioquímica de oxígeno.

La síntesis de los cuatro PDAR PDD consta de los siguientes pasos:

2.1) Preparación de tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) por Lindsey condensación [5] de tetrahydroisoindole con benzaldehídos sustituido. Para una solución 0,01 M de tetrahydroisoindole (1 eq) en CH <sub> 2 CL 2, el aldehído aromático (1 eq) se añadió en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente BF 3 O xEt 2 (0,2 eq) se añadió, y la mezcla de reacción se agitó a ta durante 2 h. DDQ (1 eq) se añadió, y la mezcla se deja toda la noche con agitación continua. La solución se lavó con un 10% aq Na 2 SO 3, el 10% aq Na 2 CO 3, 5% HCl aq y finalmente con salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na 2 SO 4, luego se concentró en el vacío. El residuo se recristaliza en CH 2 Cl 2 - terc-butil éter para dar mezcla de Ar 4 TCHP como polvo de color verde. Los rendimientos son alrededor del 50%.

2.2) La inserción de Pd para obtener PDAR 4 TCHPs. Porfirinas base libre (1 eq) fueron tratados con PdCl2 o Pd (OAc) 2 (1,2 eq) en reflujo CH 3 CN en presencia de exceso de Et3N (20 eq). La conversión fue supervisado por espectroscopia UV-vis (disolvente CH 2 Cl 2-AcOH) y se considera completo después de la banda de Soret de 468-472 nm en el dictado desaparecido. La mezcla se deja enfriar, se diluye con CH 2 Cl 2 y se filtra a través de una delgada capa de Celite para eliminar Pd (0). El disolvente se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando CH 2 Cl 2 como solvente. Fracción de color rojo oscuro se recogió, se evaporó el disolvente para dar destino PDAR 4 TCHPs en rendimiento casi cuantitativo.

2.3) PDAR 4 TBP fueron preparados por la oxidación de PDAR 4 TCHPs con el exceso de 2 veces de DDQ (16 eq) en THF a reflujo. Durante el reflujo, el color cambia de rojo oscuro a verde oscuro. El disolvente se evaporó, el ​​residuo se diluyó con CH 2 Cl 2, se lava con aq 10% Na 2 SO 3, agua y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na 2 SO 4 y se concentró en el vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (eluyente CH 2 Cl 2). La primera fracción de color verde oscuro se recogió, se concentró en vacío para dar un 85-90% de polvo de color azul-verde de PdAr4TBP.

2.4) grupos éster periférica de Pd tetrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) se hidroliza con 10 veces el exceso de KOH en 1% (v / v) de agua / THF a temperatura ambiente. El disolvente se decantó del precipitado de las sales de potasio forma de derivados de ácidos carboxílicos de la PdAr4TBP. Los sólidos se disuelven en agua, se agita durante 2 horas adicionales, se acidifica con conc. HCl a pH ~ 5.4. El precipitado obtenido se aisló por centrifugación, se lava con agua y se seca al vacío.

La protección de dendrones. Cada rama individual del dendrímero se llama dendrón. Dendrones la protección se construye a partir de aril-glicina bloques de construcción (AG). Dendrones AG puede ser fácilmente sintetizado a partir de materias primas baratas y aislado de alta pureza y el rendimiento por cromatografía de métodos libres. Síntesis de la generación 2 (G2) AG-dendrón se compone de los siguientes pasos:

2.4) Síntesis de los bloques de construcción, protegido con Boc 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide y glycineamide 3,5-dibutoxycarbonylphenyl, utilizando el método de Fischer haloacyl haluro.

2.5) El acoplamiento de los bloques de construcción con CDMT / NMM química de péptidos de acoplamiento.

2.6) desprotección del grupo amino focal agitando la solución de la dendrón G2 en TFA durante 2 horas a temperatura ambiente

2.7) Para el montaje de la dendrones mayor generación, acoplamiento / desprotección pasos se repiten.

Dendrímero montaje se logra mediante el acoplamiento de la dendrones desprotege para PdAr4TBP (o porfirina otros) utilizando la química de acoplamiento HBTU / DIPEA.

2.8) En primer lugar, los grupos de protección Boc-se eliminan de la dendrón. Por ejemplo, protegido con Boc dendrón G3 (0,58 g) se disolvió en TFA (15 ml), y la mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. El ácido se elimina por evaporación rotatoria, rindiendo el dendrón como TFA-sal. El residuo seco se disolvió en NMP (10 ml) y unas gotas de DIPEA se han añadido, para calmar las huellas de TFA.

2.9) Antes de iniciar la reacción de acoplamiento, es fundamental que se disuelva completamente la porfirina. Por ejemplo, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) se disolvió en seco NMP (65 ml) mediante calentamiento a 140 º C durante 10 minutos, bajo corriente de nitrógeno.

2.10) La solución se enfrió a temperatura ambiente, HBTU (0,211 g) se añadió, y la mezcla se agitó durante 5 min.

2.11) DIPEA (0,35 ml) se añadió a la mezcla de una parte, inmediatamente seguido por la adición de la solutiel de TFA-sal de la dendrón en NMP (véase el punto 2.8), y la mezcla se deja toda la noche con agitación.

2.12) La mezcla se vierte en un 3% aq. NaCl (350 ml), y el precipitado resultante se recogió por centrifugación y se lava con agua, metanol, y Et O 2 por la suspensión repetitivas / centrifugación para obtener el objetivo de porfirina-dendrímero.

2.13) para hidrolizar los grupos éster periférica, el dendrímero se trató primero con NME 4 OH (~ 5 mm) en DMSO / MeOH durante 20-60 min período, seguido por la eliminación del disolvente completa. Este procedimiento nos permitió generar dendrímeros con un número suficiente de grupos carboxilato para dar solubilidad acuosa. Para completar la hidrólisis, el dendrímero fue tratado con NaOH acuoso 0,1 N (noche). Como resultado, pura porfirina-dendrímero ácidos carboxílicos pueden ser aislados en los rendimientos de 80-95%.

Modificación de la periferia del dendrímero. En este punto, a partir de la misma porfirina-dendrímero, ya sea de uno o sondas de dos fotones pueden ser sintetizadas. En el primer caso, todos los grupos carboxilo periféricos se modifican con las unidades de PEG - una metodología conocida como PEGilación. En este último caso, varios grupos carboxilo son los primeros, junto con cromóforos antena de dos fotones (cumarina-343) modificado con etilendiamina (EDA) enlazadores, seguido por PEGilación de los carboxilos restantes [6]. Los dendrímeros fueron pegilado con monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av.. MW 1000) con HBTU / DIPEA química de acoplamiento.

2.14) a una solución de la dendrón en NMP (o DMF) (1-10 mM) el exceso de 1.25 veces de HBTU se añadió, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Exceso de 6.25 veces de DIPEA se añadió, seguido por la adición inmediata de un exceso de 1,25 veces el de m-PEG-NH2. La mezcla de reacción se agitó durante 2 días a temperatura ambiente. Éter dietílico se añadió a la mezcla de reacción, el precipitado formado se separa por centrifugación y re-precipitado de THF por la adición de éter dietílico.

2.15) Final de la purificación se logró con la cromatografía de exclusión por tamaño de la recogida de la fase del frente primero. Pegilado porfirina-dendrímero se disolvió en una pequeña cantidad de THF (~ 15 ml) y se carga en la parte superior de una columna cromatográfica rellena con poliestireno SEC fase (Biorad, Biobeads S-X1). La columna se eluyó con pura THF, y la banda de color oscuro en movimiento con la parte delantera fue recogida.

2.16) THF se retiró en un evaporador rotatorio, y el material restante se secó en el vacío.

3. Caracterización de la sonda

Caracterización fotofísicas incluye mediciones de los espectros de la sonda de absorción y emisión, la fosforescencia vida τ 0 y Stern-Volmer oxígeno enfriamiento constantes k q en condiciones fisiológicas.

3.1) Los espectros de absorción y emisión se obtienen en condiciones ambientales utilizando instrumentación estándar (espectrofotómetro y fluorímetro constante). ~ 1 M de las soluciones de la sonda se utilice.

3.2) A continuación, el gráfico de calibración de Stern-Volmer se obtiene. Esta es la medida más importante, porque nos permite relacionar la vida útil de la sonda a la concentración de oxígeno.

3.3) Una solución de la sonda en tampón PBS (pH 7,2) se coloca en una cubeta especial cilíndrica, que se coloca dentro de la cámara de temperatura controlada, situada dentro de una jaula de luz impermeable con puertos de fibra óptica de excitación y emisión. Las fibras se ponen en contacto con la cubeta interior de la cámara en la geometría en ángulo recto.

3.4) La cubeta se cierra con un tapón, en la que una alta sensibilidad de tipo Clark electrodo de oxígeno (CK-electrodo de oxígeno) se inserta. El tapón también contiene dos puertos de la aguja de entrada y salida de argón. El electrodo se sumerge en la solución, mientras que las agujas se limitan a proporcionar para la circulación de flujo de gas por encima de la superficie de la solución. Al principio, el argón no está conectado a la entrada.

3.5) La temperatura se ajusta al valor deseado (normalmente 36-37 ° C) y la solución se deja en agitación para el equilibrio.

3.6) La fibra de excitación se conecta al puerto de excitación de un phosphorometer digital, operado por una PC. La fuente de luz en el phosphorometer es un LED de alta potencia, cuya producción es controlada por una kHz D 333 / A bordo. La fibra de emisión está conectado a otro puerto óptico de la phosphorometer, que está acoplado a un APD altamente sensible al infrarrojo (fotodiodo de avalancha). La salida del diodo se amplifica y se introduce en el A / D del canal de la tarjeta de control mismo, lo que permite la sincronización entre la excitación y los canales de emisión.

3.7) El software de control almínimos de generación de pulsos de excitación de la longitud deseada (por ejemplo 5 o 10 ms), seguido por la recolección de la decadencia fosforescencia durante cualquier período arbitrario elegido (generalmente 2-3 ms). Tiempo para una medición de toda la vida solo es típicamente 0,5-1 s, sin embargo, las mediciones se pueden obtener con la mayor rapidez 20.10 por segundo.

3.8) La salida del electrodo de oxígeno se amplifica y se dirigió a otro un consejo / D en el mismo PC. Este es un tablero de baja frecuencia (1 kHz máx), que se utiliza para registrar el electrodo de corriente en determinados periodos de tiempo. El programa para la grabación de los datos de electrodos se ejecuta simultáneamente con el software phosphorometer.

3.9) Una vez que la temperatura de la solución es equilibrado, tanto en el phosphorometer y los programas de electrodos se inician al mismo tiempo para realizar las mediciones cada 10 s. Sus resultados son registrados de forma sincrónica en dos archivos separados. Después de eso, el argón se conecta al puerto de entrada en el tapón de la cubeta.

3.10) como el argón fluye sobre la superficie de la solución agitada, poco a poco reemplaza al oxígeno. Esto se traduce en una disminución de la corriente del electrodo y un incremento en la duración de la fosforescencia, que se mide por el phosphorometer. Por lo general, el oxígeno se desplaza forma la solución del todo después de 2 h, tiempo durante el cual los datos están totalmente automáticamente registrado en los archivos.

3.11) Después de la final de la carrera de titulación, los datos del electrodo y la vida fosforescencia se importan a un programa de análisis estándar (Origen Miocrocal por ejemplo). La corriente del electrodo depende linealmente de la concentración de oxígeno, y para el electrodo utilizado es prácticamente cero en el cero de oxígeno. A presión atmosférica, pO 2 es conocida (alrededor de 150 mm Hg). Por lo tanto, los datos de electrodo puede ser convertido directamente en la escala de oxígeno, y la trama de la vida de fosforescencia inversa vs PO 2 puede construir. Esta parcela está equipado con una línea recta por el método de mínimos cuadrados para dar el kq bloqueo del oxígeno constante como su pendiente. Vida fosforescencia t0 se obtiene a partir del mismo corte (como la inversa de la intersección) o directamente desde la medición a cero oxígeno.

3.12) Si es necesario, la valoración se repite con una solución de la sonda en la presencia de albúmina - una proteína presente en el plasma de la sangre en altas concentraciones, - con el fin de emular las condiciones que se encuentran en el sistema experimental real (la sangre de un animal en vivo). La obtención de Stern-Volmer parcelas deberán ser idénticas si el dendrímero es la protección de la sonda y así aislar a los grupos de la sonda PEG de los contactos con la albúmina. De lo contrario, la sonda y las proteínas en la sangre va a interactuar, y que dará lugar a una alteración de Stern-Volmer trama, haciendo que la ambigüedad en la medición de oxígeno.

Así obtenido constantes de calibración se utilizan en experimentos de imagen donde las concentraciones de oxígeno son un desconocido a priori.

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Acknowledgments

Apoyo de la EB007279 subvenciones y HL081273 de los EE.UU. NIH se agradece.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-methylpyrrolidinone NMP
trifluoroacetic acid TFA
diisopropylethylamine DIPEA
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate HBTU
dimethylsulfoxide DMSO
CDMT=1-chloro-3,5-dimethoxytriazine CDMT
NMM=N-methylmorfoline NMM

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References

  1. Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
  2. Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
  3. Lebedev, A. Y. Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems. Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).
  4. Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins. Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).
  5. Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions. Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).
  6. Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen. J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).
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Sinks, L. E., Roussakis, E., Esipova, T. V., Vinogradov, S. A. Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems. J. Vis. Exp. (37), e1731, doi:10.3791/1731 (2010).More

Sinks, L. E., Roussakis, E., Esipova, T. V., Vinogradov, S. A. Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems. J. Vis. Exp. (37), e1731, doi:10.3791/1731 (2010).

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