Summary
Biz fosforesans giderici ve biyolojik sistemlerde oksijen görüntüleme için porfirin-tabanlı dendritik nanosensors gözden tasarım ilkeleri oksijen ölçümleri sunuyoruz.
Abstract
Oksijen ölçüm fosforesans su verme [1, 2] tarafından aşağıdaki adımlardan oluşur: 1) prob ilgi orta (örneğin, kan veya interstisyel sıvı) teslim edilir, 2) nesne için uygun dalga boyu ışık ile aydınlatılmış heyecanlandırmak için , üçlü haline prob; 3) yayılan fosforesans toplanan ve zaman ders oksijen konsantrasyonu (veya kısmi basıncı, pO dönüştürülür fosforesans ömrü, verim için analiz
Protocol
1. Oksijen ölçüm protokolü genel tanımı
(Bu bölümde herhangi bir eylem var, ama kağıt geri kalanı anlamak için çok önemlidir. Ses eşliğinde, birkaç Power Point slaytları bir dizi olarak, örneğin, filme olabilir.)
1.1) prob ilgi ortama teslim edilir, örneğin bir hayvanın kan veya interstisyel sıvı enjekte.
1.2) nesne (doku yüzey) prob heyecanlı üçlü haline teşvik etmek için uygun dalga boyu ışık ile aydınlatılır. Tipik olarak uyarım, tek-foton mekanizması ile oluşur. Ancak, iki-foton geliştirilmiş özel problar durumunda, uyarım, yüksek çözünürlüklü mikroskopi uygulamalar problar kullanılarak izin veren iki-foton mekanizması yoluyla olabilir . Bir foton uyarım genellikle daha az uzaysal çözünürlüğü sağlar, ancak basit enstrümantasyon gerektirir ve LED tabanlı fiber-optik phosphorometers ile tek noktadan ölçümlerde kullanılabilir.
1.3) sensörü tarafından yayılan Fosforesans uzun ömürlü üçlü devlet kaynaklanır. Prob molekül özel üçlü devlet yüksek kuantum verimi vermek ve yerine floresan fosforesans yayacak şekilde tasarlanmış olmalıdır. Prob üçlü devlet iken, üçlü devlet de aktif hale getirebilirsiniz oksijen molekülleri ile çarpışma karşılaşmalar yaşayabilirsiniz - "su verme" olarak adlandırılan bir süreç Fosforesans çürüme dolayısıyla oksijen, üçüz devletin ömrü ve yokluğunda, τ 0. Oksijen varlığında, fosforesans ömrü (τ), ısıl işlem sonucu olarak kısaltılır. Üçüz devletin ömrü ve ortamda oksijen miktarı arasında doğrudan bir ilişki vardır. Bu oksijen konsantrasyonu [O 2] (veya oksijen kısmi basıncı pO2) fosforesans ömrü (τ) bağlayan bilinen Stern-Volmer ilişki:
Biyolojik sistemleri, oksijen kadar oksijen fosforesans su verme yöntemi çok seçici hale getirir fosforesans, en etkili söndürücü.
1.4) ömrü t ölçmek için, zaman içinde yayılan fosforlu fotonlar binned. Örneğin, fotonlar toplanana kadar ikaz darbe sonrasında, 200 fotonlar, bu nedenle, ilk 15 mikrosaniye önümüzdeki 15 mikrosaniye toplanan 150 fotonlar toplanan ve olabilir. Kutularına numaraları ömrü verim τ analiz fosforesans çürüme, zamana karşı çizilmiştir. Görüntülemede, bu yordamı fosforesans ömrü, haritalar, görüntünün her piksel uygulanır. Yaşamların ölçümleri, biyolojik örnekler için ortak nesne boyunca prob dağıtım heterojenite duyarsız. Böylece, ömürleri sadece oksijen rapor. Yaşamlarda τ Stern-Volmer ilişkiyi kullanarak oksijen konsantrasyonu dönüştürülür.
2. Fosforlu probları İnşaatı
Biyolojik sistemlerde oksijen ölçümleri için Fosforlu probları dendrimers yapılmış kafesler içine kapsüllü fosforlu kromoforlar (çekirdek), son derece düzenli hyperbranched polimerler oluşur [3]. Dendrimers çevre ile etkileşim çekirdeği korumak ve mümkün probların hassasiyet ve dinamik aralık (Stern-Volmer ilişkisi sabit k q) optimize etmek için, çekirdek oksijen difüzyon hızını kontrol. Dendrimers Termini probları yüksek suda çözünür ve biyolojik makromoleküller ile etkileşimleri önlemek, kimyasal olarak inert hidrofilik polietilen glikol (PEG) grupları ile modifiye edilmiştir.
Probların Fosforlu çekirdek porfirinler ve π genişletilmiş porfirin Pt veya Pd kompleksleri. π Genişletilmiş porfirinler pirol halkaları dış aromatik parçaları ile kaynaşmış olan porfirinler. π-Eklenti belirli bir görüntüleme uygulaması (örneğin mikroskopi vs tomografi) gereksinimlerini karşılamak için problar spektroskopik özellikleri ayarlama sağlar. Bir örnek olarak, Pd tetaaryltetrabenzoporphyrins sentezi (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP spektrum ve güçlü fosforesans uzak-kırmızı parçası güçlü emme bantlar var, iyi biyolojik oksijen ölçümleri için uygundur.
PdAr 4 TBP sentezi aşağıdaki adımlardan oluşur:
Lindsey yoğuşma tetraaryltetracyclohexenoporphyrins 2.1) Hazırlama (Ar4TCHP) [5] yerine benzaldehydes ile tetrahydroisoindole. 0,01 M CH tetrahydroisoindole (1 eq) bir çözüm için <alt> 2 CL 2 aromatik aldehit (1 eq), argon gazı altında eklendi . Reaksiyon karışımı RT BF 3 xEt 2 O (0.2 eq) karanlıkta 10 dakika süreyle karıştırıldı eklendi ve reaksiyon karışımı ilave bir 2 saat için rt karıştırıldı DDQ (1 eq) eklendi, karışımı sürekli karıştırma altında bir gece kaldı. 3 çözüm% 10 aq Na 2 SO yıkandı,% 10 aq Na 2 CO 3,% 5 aq HCl ve nihayet tuzlu su ile. Organik faz, daha sonra vakum yoğunlaşmış, Na 2 SO 4 üzerinden kurutulur. Tert-bütil eter karışımı Ar yeşil toz olarak 4 TCHP vermek için kalıntı CH 2 Cl 2 kristallendirildi. Verim% 50 civarında.
2.2 PD) Ekleme PdAr 4 TCHPs elde etmek için. Serbest baz porfirinler (1 eq) Et 3 N (20 eq) aşan varlığı CH 3 CN kaçmasını PdCl 2 veya Pd (oac) 2 (1.2 eq) ile tedavi edildi. UV-vis spektroskopi dönüşüm izlenir (solvent CH 2 Cl 2-AcOH) ve 468-472 nm dikte Soret bant sonra tamamlanmış sayılır kayboldu. Karışım CH 2 Cl 2 ile seyreltilmiş ve Celite Pd (0) kaldırmak için ince bir tabaka süzgecinden soğuması. Çözücü uçurulur ve kalıntı çözücü olarak CH 2 Cl 2 silika jel kolon kromatografisi ile saflaştırılır. Koyu kırmızı fraksiyon toplandı, hedef neredeyse kantitatif verim PdAr 4 TCHPs vermek çözücü uçurulur.
2.3) PdAr 4 TBP PdAr 4 TCHPs oksidasyonu kaynatılır THF DDQ 2 kat daha fazla (16 eq) tarafından hazırlanmıştır. Reflüye yol boyunca, derin, koyu kırmızı-yeşil renk değiştirdi. Çözücü buharlaştırılır, kalıntı% 10 aq Na 2 SO 3, su ve tuzlu su ile yıkanır, CH 2 Cl 2 ile sulandırıldı. Organik faz Na 2 SO 4 üzerinden kurutulur ve vakum yoğunlaşmıştır. Kalıntı silika jel kromatografisi (Eluent CH 2 Cl 2) ile saflaştırılır oldu. PdAr4TBP Kullanıcı mavi-yeşil bir toz% 85-90 vermek vakum konsantre ilk koyu yeşil fraksiyonu toplanmıştır.
2.4) Pd, Periferik ester gruplarının Tetrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl) tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP)% 1 (v / v) su / rt az THF KOH 10 kat daha fazla kullanarak hidrolize edildi. Solvent PdAr4TBP Kullanıcı karboksilik asit türevleri oluşan potasyum tuzları çökelti dekante oldu. Suda çözünmüş katı madde, kons ile asitlendirilmiş ek 2 saat, kıpırdandı. HCl pH: ~ 4-5. Elde edilen çökelti su ile yıkanır ve kurutulur vakum, santrifüj yoluyla izole edilmiştir.
Dendrons korunması. Dendrimer Her bireysel şube dendron denir. Korunması dendrons aril-glisin (AG) yapı taşlarını inşa edilir. AG dendrons kolayca ucuz başlangıç maddeleri sentezlenen ve kromatografisi-yöntemleri ile yüksek saflık ve verim izole edilebilir. Yeni nesil 2 (G2) AG-dendron sentezi aşağıdaki adımlardan oluşur:
Fischer haloacyl halide yöntemi kullanarak yapı taşları 2.4) sentezi, Boc korumalı, 3,5 dicarboxyphenyl glycineamide ve 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide.
2.5) CDMT / NMM peptid kaplin kimya kullanarak yapı taşlarından Kaplin.
2.6), oda sıcaklığında 2 saat TFA G2 dendron çözümü karıştırma fokal amino grubu access
2.7) daha yüksek nesil dendrons montajı için, kaplin / deprotection adımları tekrarlanır.
Dendrimer montaj HBTU / DIPEA kaplin kimya PdAr4TBP (ya da diğer porfirin) kullanarak deprotected dendrons kaplin ile elde edilir .
2.8) İlk olarak, Boc koruyucu gruplar dendron kaldırılır. Örneğin, Boc korumalı G3 dendron (0.58 g) TFA (15 ml) dağıldı ve karışım 2s RT tepki kaldı. Asit TFA tuzu olarak dendron verimli, döner buharlaşma tarafından kaldırıldı. Kalıntı kuru NMP (10 ml) içinde çözünmüş ve TFA izlerini gidermek için, DIPEA bir birkaç damla ilave edildi.
2.9) kaplin reaksiyon başlamadan önce, porfirin tamamen erimesi için kritik öneme sahiptir. Örneğin, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0.061 g), 140 kuru NMP (65 ml) ısıtma dağıldı ° C 10 dakika, azot akışı altında.
2.10) çözümü oda sıcaklığına kadar soğutulur, HBTU (0,211 g) eklendi ve karışım 5 dakika süreyle karıştırıldı.
2.11) DIPEA (0.35 ml), hemen soluti ek ardından, bir kısmı karışıma eklendiNMP dendron (2.8) TFA-tuz karışımı geceleme karıştırma altında kaldı.
2.12) karışımı% 3 aq dökülür. NaCl (350 ml), ve ortaya çıkan çökelti santrifüj tarafından toplanan ve tekrarlayan süspansiyon / santrifüj hedef porfirin-dendrimer verim için su, MeOH ve Et 2 O ile yıkandı.
Periferik ester gruplarının hidroliz için 2.13) dendrimer, ilk olarak 20-60 dk süre içinde tam solvent kaldırma takip DMSO / MeOH NME 4 OH (~ 5 mM) ile tedavi edildi. Bu prosedür, sulu çözünürlük vermek karboksilat grupların yeterli sayıda dendrimers oluşturmak için izin verdi. Hidroliz tamamlamak için, dendrimer 0.1N sulu NaOH (gece) ile tedavi edildi. Sonuç olarak, saf porfirin-dendrimer karboksilik asitler,% 80-95 verim izole olabilir.
Dendrimer çevre modifikasyonu Bu noktada, aynı porfirin-dendrimer başlayarak, ya bir ya da iki-foton probları sentezlenmiş olabilir. İlk durumda, tüm periferik karboksil grubu PEG birimleri ile değiştirilir - PEGylation olarak bilinen bir yöntem. İkinci durumda, birkaç karboksil grubu ilk iki foton anten kromoforlar (Kumarin-343) kalan carboxyls PEGylation takip etilendiamin (EDA) linkers ile modifiye edilmiş [6]. Birleştiğinde Dendrimers HBTU / DIPEA kaplin kimya kullanarak monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. MW 1000) kullanarak pegile.
NMP dendron (veya DMF) (1-10 mM) HBTU 1.25 kat daha fazla bir çözüm için 2.14) eklendi ve reaksiyon karışımı oda sıcaklığında 10 dakika karıştırılır. M-PEG-NH2 1.25 kat daha fazla hemen ilave edilerek takip DIPEA 6.25-Fold fazla eklendi. Reaksiyon karışımı rt az 2 gün süreyle karıştırıldı. Dietil eter reaksiyon karışımına eklendi, oluşan çökelti THF dietil eter eklenerek santrifüj ve yeniden çöktürülmüş ayrıldı.
2.15) Final arıtma ilk ön faz toplama boyut dışlama kromatografisi ile elde edildi. Pegile porfirin-dendrimer THF (~ 15 ml) küçük bir miktar çözülür ve polistiren SEC faz (Biorad, Biobeads S-X1) ile dolu bir kromatografik sütun üstüne yüklenmişti. Sütun saf THF ile yıkandı ve ön hareket eden koyu renkli bant toplanmıştır.
2.16) THF döner buharlaştırıcı çıkarıldı ve geri kalan malzeme vakum kurutulur.
3. Probe karakterizasyonu
Photophysical karakterizasyonu prob absorpsiyon ve emisyon spektrumları, fosforesans ömürleri τ 0 ve Stern-Volmer oksijen su verme sabitleri k q altında fizyolojik şartlar ölçümleri içerir.
3.1), standart enstrümantasyon (spektrofotometre ve kararlı flüorometre) kullanarak ortam koşulları altında absorpsiyon ve emisyon spektrumları elde edilir. ~ 1 mcM çözümler prob kullanılır.
3.2) yanında, Stern-Volmer kalibrasyon arsa elde edilir. Bu, en önemli ölçü, bize oksijen konsantrasyonu probun ömrü ilişki sağlar çünkü.
3.3), PBS (pH 7.2) probu bir çözüm portları ile uyarma ve emisyon optik fiberler ışık geçirmez bir kafes içinde bulunan ısı kontrollü odasının içine yerleştirilmiş özel bir silindirik küvet yerleştirilir. Lifler dik açılı geometri odası içinde küvet ile yakın temas haline getirilir.
3.4) küvet içine son derece hassas bir Clark-tipi oksijen elektrot (CK-oksijen elektrot) eklenir, bir stoper ile kapatılmıştır. Stoper de argon giriş ve çıkış için iki iğne portları içerir. Iğneler sadece çözüm yüzeyi üzerinde gaz akışını akışını sağlamak ise elektrot, çözüm içine batırılır. İlk başta, argon girişine bağlı değildir.
3.5), sıcaklık istenen değere (genellikle 36-37 ° C) ayarlanır ve çözüm dengeleme için karıştırma altında bırakılmıştır.
3.6) uyarma fiber bir PC tarafından işletilen bir dijital phosphorometer ikaz portu, bağlı. Phosphorometer çıkış 333 kHz D / A yönetim kurulu tarafından kontrol edilir bir yüksek güç LED ışık kaynağı. Emisyon fiber optik, son derece duyarlı kızılötesi APD (çığ fotodiyot) ile birleştiğinde phosphorometer, başka bir bağlantı noktasına bağlanır. Diyot çıkış amplifiye ve eksitasyon ve emisyon kanalları arasında senkronizasyon sağlayan aynı kumanda panosu, A / D kanal içine beslenir.
3.7) kontrolü yazılımı aluyarma bakliyat, rasgele seçilen bir süre (genellikle 2-3 ms) sırasında fosforesans çürüme koleksiyon tarafından istenen herhangi bir uzunluğu (örneğin 5 veya 10 ms), alçak nesil. Tek bir ömür boyu ölçümü için gerekli süre genellikle 0.5-1 s, ancak, ölçümler gibi hızla saniyede 10-20 olarak elde edilebilir.
3.8) aynı bilgisayarda başka bir A / D board içine oksijen elektrot çıkış amplifiye ve yönlendirilir. Bu, belirli zaman dilimlerinde geçerli olan elektrot kaydetmek için kullanılan düşük frekanslı kurulu (1 kHz max). Elektrot veri kayıt için program phosphorometer yazılımı ile aynı anda çalışır.
3.9), çözüm sıcaklığı dengelenmiş sonra phosphorometer ve elektrot programları ölçümleri her 10 sn gerçekleştirmek için, aynı anda başlatıldı. Onların çıkışları iki ayrı dosyalar halinde eş zamanlı olarak kaydedilir. Bundan sonra, argon, küvet stoper giriş bağlantı noktasına bağlanır.
3.10), argon gibi karıştırılır çözüm yüzey üzerinde akar, yavaş yavaş oksijen yerine geçer. Elektrot akımı bir azalma ve fosforesans ömrü, phosphorometer ile ölçülen bir artış ile sonuçlanır. Genellikle, oksijen verileri tamamen dosyaları otomatik olarak kaydedilir ve bu süre boyunca, yaklaşık 2 saat sonra tamamen formu çözüm yerinden edilir.
3.11) titrasyon çalışması sona erdikten sonra, elektrot veri ve fosforesans ömürleri standart bir analiz programı (örneğin Miocrocal Kökeni) alınır. Oksijen konsantrasyonu elektrot akımı doğrusal bağlıdır ve elektrot için sıfır oksijen neredeyse sıfırdır. Atmosferik basınç altında, pO 2 (150 mm Hg hakkında) bilinir. Böylece, elektrot veri doğrudan oksijen ölçeğine dönüştürülür, vs pO 2 ters fosforesans ömrü, arsa ve inşa edilebilir. Bu komplo, eğim gibi oksijen su verme sabit kq vermek için en küçük kareler yöntemi kullanarak düz bir çizgi ile donatılmıştır. Fosforesans ömrü t0 da aynı uyum (önünü ters gibi) ya da doğrudan sıfır oksijen ölçüm elde edilir.
3.12), yüksek konsantrasyonlarda kan plazma bulunan bir protein, - Gerekirse, albümin varlığında prob bir çözüm kullanarak titrasyon tekrarlanır koşulları taklit etmek amacıyla (bir hayvanın kan gerçek deneysel sistem bir araya geldi in vivo). Elde Stern-Volmer araziler dendrimer prob iyi koruyor ve PEG gruplar albümin ile temas probu izole eğer aynı olmalıdır. Aksi takdirde, prob ve kan proteinleri etkileşimde bulunacak ve oksijen ölçümleri belirsizlik neden değişmiş bir Stern-Volmer arsa yol açacaktır.
Böylece elde edilen kalibrasyon sabitleri, oksijen konsantrasyonu, a priori bir bilinmeyen görüntüleme deneylerinde kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NIH ABD'den EB007279 ve HL081273 hibe desteği minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-methylpyrrolidinone | NMP | ||
| trifluoroacetic acid | TFA | ||
| diisopropylethylamine | DIPEA | ||
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate | HBTU | ||
| dimethylsulfoxide | DMSO | ||
| CDMT=1-chloro-3,5-dimethoxytriazine | CDMT | ||
| NMM=N-methylmorfoline | NMM |
References
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Lebedev, A. Y. Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems. Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).
- Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins. Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).
- Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions. Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).
- Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen. J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).
