שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Summary

בתגובה Optokinetic כבר בשימוש נרחב על מנת להעריך את תפקודי הראייה של דג הזברה הזחל. עם זאת, פרוטוקול סטנדרטי דגים הזחל עדיין לא החלים בקלות במבוגרים

Abstract

בתגובה Optokinetic (OKR) היא התנהגות בעלי חיים רוטט עיניו לעקוב סריג מסתובב סביבו. זה כבר בשימוש נרחב על מנת להעריך את תפקודי הראייה של הזחל דג הזברה ^1-5. עם זאת, פרוטוקול סטנדרטי דגים הזחל עדיין לא החלים בקלות zabrafish מבוגר. הנה, אנחנו מציגים כיצד למדוד את OKR של דג הזברה מבוגר עם מנגנון פשוט שהותקן שלנו באמצעות פרוטוקול חדש אשר הוקם במעבדה שלנו. שני מנגנוני שלנו צעד אחר צעד בהליך של OKR ב דג הזברה מבוגר מומחשים וידאו. בנוסף, מדידות של OKR הזחל, כמו גם את התגובה optomotor (OMR) בדיקה של דג הזברה מבוגרים, הם הפגינו גם בסרטון הזה. זה assay OKR של דג הזברה מבוגר בניסוי שלנו עשוי להימשך עד 4 שעות. מבחן OKR כזה מיושם הדגים הבוגרים ייהנו לחקירה פונקציה חזותית יעילה יותר כאשר הדגים הבוגרים מערכת הראייה היא מניפולציה.

סו צ'י Zou וו יין תרמו באופן שווה על הנייר הזה.

Protocol

חלק א: בניית המנגנון OKR

פרטים מוצגים הפגנה וידאו.

חלק שני: OKR של דג הזברה למבוגרים

אם המעבדה שלך בנתה מנגנון OKR, המפתח של מבוגר דג הזברה OKR היא להחזיק את הדג. בחלק זה, אנו יראה לכם צעד אחר צעד.

המנגנון שלנו מלחינה החלקים הבאים דומים אחרים שהוזכרו. חדר דגים החוזר 7.0 ס"מ קוטר חיצוני, 6.5 ס"מ קוטר פנימי, 7.0 ס"מ גבוהה. התוף סביב החדר דגים 8.5 ס"מ קוטר החוצה, 7.5 ס"מ קוטר פנימי, 7.0 ס"מ גבוהה. זה יכול לסובב עם כיוון השעון ונגד כיוון השעון במהירות של 20 ~ 70 סיבובים לדקה (סל"ד). אחד עשר מחזורים של פסים בשחור לבן נמשכים על נייר העתקה אשר דבק בצד החיצוני של התוף. מערכת האור מורכב משני צינורות אור מעגל בקוטר 21 ס"מ.

באיור 1. המודל של ספוג. הצוק עשה באמצע זה היא לוודא כי שדה הראייה לא היה להיות מוגן.

1. ספוג כפי שמוצג תמונה 1 שהלחין לשני חלקים. החלק השמאלי הוא באורך 3 ס"מ X 3 ס"מ רוחב x גבוה 2 ס"מ. החלק הנכון הוא באורך 3 ס"מ X 3 ס"מ רוחב x גבוה 3 ס"מ.
2. שים את זה הספוג בחלק התחתון של החדר דגים לשפוך מים לגידול לעומק כ 2 ס"מ. בועות האוויר אשר להסתתר הספוג צריך להיות מודח.
3. הכנס סיכה בחלק הקדמי של החלק הימני של ספוג, על 2 מ"מ מאחורי הצוק.
4. הרדימי דג הזברה מבוגר ב-MS-222.
5. שים את דג הזברה על הספוג עם למעלה הגב ולאפשר צד אחד של סנפיר החזה שלו לפני הפין הראשון.
6. סיכה השני מוכנס מאחורי סנפיר החזה אחרים. זה יכול למנוע הגוף מתכווץ דג הזברה על ידי שיתוף פעולה עם הסיכה הראשונה (ראה גם באיור. 2).
7. הצמד את זנבו עם עורק מהדק ולתקן את מהדק עורק בפיסת גומי (פלסטלינה) אשר דבק על החדר דגים.
8. הסיכה השלישי והרביעי נטוע באתר ביוב ליד נקבוביות הגוף דגים. זה יכול למנוע דג הזברה לגל בזנבו בעוצמה.
9. סיכה החמישי הוא מוצב בין הראשונה את הסיכה השלישית ואז את הסיכה השישי הוא בצד השני של זה. הם יכלו למנוע את דג הזברה מן רעד בגוף שלה.
10. סיכה השביעי והשמיני מוכנס האתרים ליד הזימים כדי לשמור על האוריינטציה הראש.
11. יוצקים מים לגידול דגים בתא.
12. אחרי דג הזברה מתעוררת, תן לו להסתגל עבור 5 ~ 10 דקות.
13. תדליק את האור של המנגנון הזה ולתת דג הזברה להתאים את התאורה במשך 2 דקות.
14. הפעל את המנוע בכונן הסורג ולאפשר דג הזברה להסתגל למשך דקה 1.
15. הפעל את המצלמה ולתעד את תנועת העיניים.
16. נתח את זוויות העין ⁶ ומספרי saccade במחשב האישי (למשל נציג של ניתוח עין זוויות מוצג Fig.2).

איור 2. הזווית בין ציר לציר העין הגוף.

א) כאשר הכיוון של הסורג הוא האף אל הזמני, הגדרנו את הזווית של הגוף קדימה דגים זווית שלילית את הזווית הגוף דגים זווית חיובית, ולהיפך (לסקירה קצרה גם לראות שופט. 6). מספרים נתון זה מייצג את הרצף של סיכות.

ב) OKR למשל ניתוח של דג אחד בקבוצה רגילה. סרט אחד השני הועבר מסגרות הסדרה ואת זוויות העין של כל מסגרת נמדדה עם תמונה הפרו תוכנה פלוס. כל נקודה נתון זה מייצג את כל מסגרת מדדנו.

הערות:

1. כל הפינים משמשים רק כדי למנוע דג הזברה מן הגוף שלה רועד, הדוקה מדי יהיה מזיק לדגים.
2. מהדק העורקים עלולה לפגוע הזנב כשטח מגע שלו קטן. לאחר הזנב היא בחינם, זה ים קשה מאוד לתקן את זה דגים. לעטוף תחבושת סביב הזנב מומלץ במצב כלשהו.
3. הסיכה השביעית והשמינית אשר נטועים באתר ליד הזימים לא צריכה להיות מקלט מן העין שלהם צורמת.

חלק III. OKR הזחל של דג הזברה

1. Methylcellulose

הזחל דג הזברה יכול להיות משותקת פתרון methylcellulose 6% תוך כדי להישאר בחיים זמן רב. הכן פתרון methylcellulose כדלקמן.

1. מרתיחים 200 מ"ל DDH ₂ O בתנור מיקרוגל כ 3 דקות ברמה גבוהה.
2. העברת מים חמים פלטה חמה בחישה ומערבבים במרץ.
3. מוסיפים 12 גרם methylcellulose למים חמים בהדרגה.
4. שמור ערבוב במשך 3 דקות לאחר methylcellulose היטב התפזרו.
5. מצננים את הפתרונות עם מי קרח עד שיתברר, ואז למקם אותו על 4 ° C.

1. שני זוגות זכר ונקבה של דג הזברה הבוגרת טנק ההזדווגות בשעה 17:00 לאחר ההנקה. למחרת בבוקר ולהעבירם טנק ההזדווגות טריים לאסוף עוברים אחרי שעה 1.
2. הביצים נשמרות בינוני העובר ב 28.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס אינקובטור עם אור: מחזור האפל של 14:10.
3. ביצים יהיה בקעו החוצה הפריה 48 שעות שלאחר (hpf) ואת OKR תיבחן על hpf 72 או מאוחר יותר. בסרטון הזה, larvaes נמצאים DPF 5.

3. נוהל של OKR

1. שים את המנגנון תחת stereoscope מצויד במצלמת CCD ו להדליק את האור של מנגנון זה.
2. הוסף 20 מ"ל methycellulose 6% בצלחת פטרי 55 מ"מ.
3. המקום larvaes רצופים במרכז של המנה הזו.
4. שים בועת אוויר על בהיקף של μl 1 בתחום המצלמה, זה יכול להיות כמראה לשקף את הכיוון של הסורג.
5. הפעל את המנוע ולהקליט את תנועת העיניים שלהם.

חלק ד '. OMR למבוגרים של דג הזברה

למבוגרים דג הזברה OMR יכול גם להיות שנערך עם המנגנון הזה, רק במקום הטור בתא דגים למניעת דגים שוחים על פני מרכז (הראו ב Fig.3a, מהירות סיבוב 36 סל"ד הוא, שחור לבן מחזורים הם 11).

1. שים דג בתא זה דגים.
2. Stand טור בקוטר 2 ס"מ במרכז תא זה דגים.
3. התאם לרגע אחד הן עדיין צורם צורם הסיבוב.
4. שיא התנועה של דג הזברה.
5. ניתוח שיעור מקרי הזמן במחשב האישי (דוגמה מוצגת Fig.3b, מהירות סיבוב 36 סל"ד הוא, שחור לבן מחזור 11)

איור 3. OMR של דג הזברה למבוגרים. (א) בעמודה A פלסטיק לבן שהונח במרכז החדר דגים למניעת דגים שוחים על פני זה. (ב) שיעור מקרי של דג הזברה הבוגרת בעקבות צורמת. שיעור מקרי הוגדר חלקם של זמן צורמת הבאים זמן ההקלטה הכולל. הערך של 50% מצביעה על כך הדג הוא שוחה באופן אקראי תוך 100% מציין את הסורג הבאים דגים היטב. עצבי הראייה הן נמחצו עם מלקחיים תכשיטים כ -10 שניות. ההתנהגות של OMR הופיע שחייה אקראי לאחר למחוץ.

Discussion

על פי ההגדרה של OKR, היא תופעה חיות להזיז את עיניהם להמשיך סריג מסתובב באופן ספונטני. אם התנהגות זו התנהל במשך זמן רב (למשל, מעל 6 שעות), שרירי העין יכול להיות עייף OKR יהיה נחלש.

למבוגרים דג הזברה OMR תוארה לחלוטין על ידי אחרים ^7. בסרטון הזה, אנחנו רק להראות לך את ההתנהגות הזאת עם המנגנון שלנו. לאחר עצבי הראייה הם כתוש, הם לא יכלו לעקוב אחר זה צורם מאוד.

ביצענו בדיקה OKR התנהגות דג הזברה למבוגרים, OMR הזחל וגם מבוגרים עם מנגנון פשוט שהותקן שלנו כדי להעריך את תפקוד הראייה של דג הזברה. זה assay OKR של דג הזברה מבוגר בניסוי שלנו יכול להחזיק מספיק חזק בתוך תקופה של 4 שעות בלי לפגוע בו. זה עשוי להיפתח מבחן OKR במחקר הדגים הבוגרים לתפקד ביעילות רבה יותר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385	Viscosity 25 cP