Usando la respuesta de optocinético para estudiar la función visual del pez cebra

Summary

Optocinético respuesta ha sido ampliamente utilizada para evaluar las funciones visuales de larvas de pez cebra. Sin embargo, el protocolo estándar para las larvas de peces aún no es fácilmente aplicable en los adultos

Abstract

Respuesta optocinético (okr) es un comportamiento que un animal hace vibrar sus ojos para seguir una rejilla girando alrededor de ella. Ha sido ampliamente utilizada para evaluar las funciones visuales de las larvas de pez cebra ^1-5. Sin embargo, el protocolo estándar para las larvas de peces aún no es fácilmente aplicable en zabrafish adultos. Aquí, presentamos la forma de medir la okr de adultos de pez cebra con nuestro simple costumbre-construido aparatos que utilizan un nuevo protocolo que se establece en nuestro laboratorio. Tanto nuestro equipo y paso a paso el procedimiento de okr en adultos de pez cebra se muestran en este video. Además, las mediciones de la okr larvas, así como la respuesta optomotor (OMR) la prueba de adultos de pez cebra, también se demuestra en este vídeo. Este ensayo okr de pez cebra adulto en nuestro experimento puede durar hasta 4 horas. Prueba okr como aplicada en peces adultos se beneficiarán con la investigación de la función visual más eficientemente cuando los peces adultos sistema de visión se manipula.

Su-Qi Zou y Wu Yin contribuyeron igualmente a este trabajo.

Protocol

Parte I: Construir el aparato okr

Los detalles se muestran en el vídeo de demostración.

Parte II: okr de adultos de pez cebra

Si su laboratorio ha construido un aparato okr, la clave de los adultos de pez cebra okr es mantener a los peces. En esta parte, vamos a mostrar paso a paso.

Nuestro aparato compone las siguientes partes similar a los otros mencionados. La cámara circular de pescado es de 7,0 cm de diámetro exterior, 6,5 cm de diámetro interior y 7,0 cm de alto. El tambor alrededor de la cámara de pescado es de 8,5 cm de diámetro a cabo, 7,5 cm de diámetro interior y 7,0 cm de alto. Podría girar en sentido horario y antihorario con la velocidad de 20 ~ 70 rotaciones por minuto (rpm). Once ciclos de rayas blanco y negro se dibuja en un papel los trazos que se adhirió en el exterior del tambor. El sistema de iluminación se compone de dos tubos de un círculo de luz de diámetro de 21 cm.

Figura 1. El modelo de la esponja. El acantilado hecho en este medio es para asegurarse de que el campo visual no se estaba protegido.

1. Una esponja como se muestra en la Fig. 1 compuesto por dos partes. La parte izquierda es la longitud de 3 cm de ancho x 3 cm de alto x 2 cm. La parte derecha es la longitud de 3 cm de ancho x 3 cm de alto x 3 cm.
2. Añadir este esponja en la parte inferior de la cámara de pescado y vierta el agua en la crianza de unos 2 cm de profundidad. Burbuja de aire que se esconden en la esponja debe ser expulsado.
3. Insertar un pin en la parte delantera de la parte derecha de la esponja, de unos 2 mm por detrás del acantilado.
4. Anestesiar un pez cebra adulto en el MS-222.
5. Poner el pez cebra en la esponja con un máximo de dorsales y permitir que una parte de su aleta pectoral antes de que el primer pin.
6. El segundo pasador se inserta detrás de la aleta pectoral otros. Se podría evitar el cuerpo del pez cebra reducción mediante la cooperación con el primer pasador (ver también en la fig. 2).
7. Abrazadera de la cola con una pinza de la arteria y fijar la pinza de la arteria en un trozo de goma (arcilla) que se adhiere a la cámara de los peces.
8. El pasador de tercer y cuarto se planta en el sitio cerca de la cloaca de los poros del cuerpo de los peces. Podría prevenir el pez cebra para saludar la cola intensamente.
9. El pin quinta está situada entre el primer y el tercer pin y luego el pin sexto en el otro lado de la misma. Que podrían prevenir el pez cebra de la sacudida de su cuerpo.
10. El pasador de séptimo y octavo se inserta en los sitios cerca de las agallas para mantener la orientación de la cabeza.
11. Vierta el agua en la cámara de cría de peces.
12. Después de que el pez cebra se despierta, vamos a adaptarlo a 5 ~ 10 minutos.
13. Encender la luz de este aparato y dejar que el pez cebra adaptar este tipo de iluminación durante 2 minutos.
14. Encienda el motor para impulsar la rejilla y permiten adaptar el pez cebra durante 1 minuto.
15. Encienda la cámara y registrar el movimiento de los ojos.
16. Analizar los ⁶ ángulos de los ojos y los números sacada en su ordenador personal (un ejemplo representativo del análisis de los ángulos del ojo se muestra en la Fig. 2).

Figura 2. El ángulo entre el eje óptico y el eje del cuerpo.

a) Cuando la dirección de la rejilla es nasal a temporal, que define el ángulo en el frente del cuerpo de los peces es un ángulo negativo y el ángulo en el cuerpo de los peces es un ángulo positivo, a la inversa (para una revisión breve también ver ref. 6). Los números en esta cifra representa la secuencia de los pines.

b) okr ejemplo, el análisis de un pez en el grupo normal. Una película de un segundo fue trasladado a una serie de cuadros y los ángulos de los ojos de cada cuadro se midió con Image-Pro Plus. Cada punto en que esta cifra representa cada cuadro se midió.

Notas:

1. Todos los pines son utilizados para prevenir el pez cebra de la sacudida de su cuerpo, demasiado apretado será perjudicial para los peces.
2. Abrazadera puede dañar la arteria de la cola como su área de contacto es pequeño. Una vez que la cola es libre, s muy difícil de solucionar este pescado. Envuélvalo con una venda alrededor de la cola se recomienda en algunas condiciones.
3. El pasador de séptimo y octavo que se plantan en el sitio cerca de enmalle no debe ser refugio de su vista de la rejilla.

Parte III. Okr de las larvas de pez cebra

1. Metilcelulosa

Las larvas de pez cebra puede ser inmovilizado en una solución de metilcelulosa al 6%, mientras que mantener vivo durante mucho tiempo. Prepare una solución de metilcelulosa de la siguiente manera.

1. Hervir 200 ml _ddH2O en el microondas unos 3 minutos a alto nivel.
2. Transferir el agua caliente a una placa de agitación y se remueve vigorosamente.
3. Agregar 12 g de metilcelulosa en el agua caliente poco a poco.
4. Mantener la agitación durante 3 minutos después de la metilcelulosa es muy dispersa.
5. Enfriar la solución con agua helada hasta que se aclare, y luego se coloca a 4 ° C.

1. Dos pares macho y una hembra de pez cebra adulto en un tanque de acoplamiento a las 17:00 horas después de comer. A la mañana siguiente transferirlos a un depósito de apareamiento fresca y recoger los embriones después de 1 hora.
2. Los huevos se mantienen en un medio de embriones en un 28,5 ± 0,5 ° C incubadora con la luz: oscuridad ciclo de 14:10.
3. Los huevos serán incubados durante 48 horas después de la fecundación (HPF) y el okr se pondrá a prueba a las 72 HPF o más adelante. En este video, las larvas se encuentran en 5 fdd.

3. Procedimiento de okr

1. Poner el aparato en el estereoscopio equipado con cámara CCD y encender la luz de este aparato.
2. Añadir 20 ml Metilcelulosa 6% en un plato de petri de 55 mm.
3. Lugar larvas de varios en una fila en el centro de este plato.
4. Ponga una burbuja de aire sobre un volumen de 1 l en el campo de la cámara, podría ser como un espejo para reflejar la dirección de la rejilla.
5. Encienda el motor y registrar el movimiento de sus ojos.

Parte IV. OMR de adultos de pez cebra

Pez cebra adulto OMR también podría llevarse a cabo con este aparato, basta con colocar una columna en la cámara de peces para la prevención de los peces que nadan a través del centro (mostrado en Fig.3a, velocidad de rotación es de 36 rpm, blanco y negro son los ciclos de 11).

1. Ponga un pez en esta cámara de pescado.
2. Pie de una columna de 2 cm de diámetro en el centro de esta cámara de peces.
3. Adaptarse durante un minuto, tanto en todavía rejilla y la reja de rotación.
4. Registrar el movimiento del pez cebra.
5. Analizar el tipo de coincidencia de la hora de su ordenador personal (un ejemplo se muestra en Fig.3b, velocidad de rotación es de 36 rpm, negro-blanco del ciclo es de 11)

Figura 3. OMR de adultos de pez cebra. (A) Una columna de plástico blanco se colocó en el centro de la cámara de pescado para la prevención de los peces que nadan a través de ella. (B) El tipo de coincidencia de los adultos de pez cebra después de la rejilla. La tasa de coincidencia se definió como la proporción de la rejilla de tiempo después de que el tiempo de grabación total. El valor del 50% indica que el pez está nadando al azar mientras que el 100% indica la rejilla siguientes peces muy bien. Ambos nervios ópticos fueron aplastados con una pinza de la joyería de unos 10 segundos. El comportamiento de los OMR apareció como una piscina al azar después de aplastar.

Discussion

De acuerdo con la definición de okr, es un fenómeno que los animales se mueven sus ojos para seguir una rejilla de rotación de manera espontánea. Si este comportamiento se ha realizado durante mucho tiempo (por ejemplo, por encima de 6 horas), los músculos del ojo puede estar cansado y el okr será atenuada.

Pez cebra adulto OMR ha sido descrita completamente por otros ^7. En este vídeo, acaba de mostrar este comportamiento con nuestro aparato. Una vez que los nervios ópticos se trituran, no podría seguir esta rejilla muy bien.

Hemos realizado pruebas okr comportamiento en adultos, larvas de pez cebra y OMR, en adultos con nuestro simple costumbre-construido un aparato para evaluar la función visual del pez cebra. Este ensayo okr de pez cebra adulto en nuestro experimento podría mantener lo suficientemente fuerte en un plazo de 4 horas sin perjudicarla. Esto podría abrir okr prueba en el estudio de los peces adultos función de manera más eficiente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385	Viscosity 25 cP