संयंत्र सेल दीवारों के व्यापक compositional विश्लेषण (lignocellulosic बायोमास) भाग मैं: Lignin
Summary
संयंत्र बायोमास एक प्रमुख कार्बन न्यूट्रल अक्षय संसाधन है कि जैव ईंधन के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बायोमास संयंत्र सेल दीवारों, एक structurally जटिल समग्र सामग्री lignocellulosics करार दिया के मुख्य रूप से होते हैं. यहाँ हम polyphenolic लिग्निन की सामग्री और संरचना के एक व्यापक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.
Protocol
1. सेल वॉल अलगाव हवा या फ्रीज सूखे पौधे सामग्री के 60 70mg – मोटे तौर पर एक 2 मिलीलीटर Sarstedt पेंच टोपी एक iWall का उपयोग कर ट्यूब में 5.5 मिमी स्टेनलेस स्टील गेंदों के साथ पीस, एक पीस और वितरण रोबोट (30 s). एक वैकल्पिक गैर रोबोट कम throughput प्रक्रिया का उपयोग कर एक गेंद मिल (retschmill) द्वितीय भाग 2 में प्रस्तुत किया है . तिरस्कृत जमीन सामग्री, और अच्छी तरह भंवर में 70% के जलीय इथेनॉल के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें. 10 गोली न्यूनतम शराब अघुलनशील अवशेषों के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र. Aspirate या सतह पर तैरनेवाला छानना. / क्लोरोफॉर्म मेथनॉल (01:01 v / v) के अवशेषों का हल 1.5 मिलीलीटर जोड़ें और गोली resuspend ट्यूब अच्छी तरह हिला. 10 मिनट के लिए 10,000 rpm और सतह पर तैरनेवाला aspirate या छानना अपकेंद्रित्र. एसीटोन के 500 μl में Resuspend गोली. 35 पर हवा की एक धारा ° सी के साथ शुष्क जब तक विलायक लुप्त हो जाना. यदि जरूरत सूखे नमूने प्रसंस्करण आगे तक कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है है. नमूना से स्टार्च की हटाने को आरंभ करने के लिए एक 0.1 एम सोडियम एसीटेट बफर पीएच 5.0 की 1.5 मिलीलीटर में गोली resuspend. 20 मिनट के लिए Sarstedt ट्यूबों और गर्मी कैप. 80 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक में. बर्फ पर निलंबन अच्छा है. गोली निम्नलिखित एजेंट जोड़ें: 0.01% सोडियम azide (NaN3) के 35 μl, 35 μl (50 μg / एमएल एच 2 हे, सिग्मा, बेसिलस प्रजातियों से); amylase 17 μl pullulanase (बैसिलस acidopullulyticus से 17.8 इकाइयों, सिग्मा) . ट्यूब और अच्छी तरह भंवर कैप. निलंबन रात से अधिक 37 incubated ° सी प्रकार के बरतन में. Orienting ट्यूब क्षैतिज सहयोगियों मिश्रण में सुधार. हीट निलंबन पर 100 डिग्री सेल्सियस पाचन को समाप्त करने के लिए एक हीटिंग ब्लॉक में 10 मिनट के लिए. (10,000 rpm, 10 मिनट) अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला युक्त solubilized स्टार्च त्यागें. 1.5 मिलीलीटर पानी जोड़ने, vortexing, centrifuging, और धोने के पानी के decanting शेष गोली तीन बार धोएं. एसीटोन के 500 μl में Resuspend गोली. 35 पर हवा की एक धारा ° सी के साथ शुष्क जब तक विलायक लुप्त हो जाना. बेहतर सुखाने के लिए एक रंग के साथ सामग्री को तोड़ने ट्यूब में यह आवश्यक भी हो सकता है. सूखे सामग्री पृथक सेल दीवार (lignocellulosics) प्रस्तुत करता है. यदि जरूरत सूखे नमूने प्रसंस्करण आगे तक कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है है. 2. Lignin सामग्री इस विधि Fukushima और Hatfield 3 द्वारा एक रिपोर्ट पद्धति पर आधारित है. वजन 1 – तैयार कोशिका दीवार सामग्री के 1.5 मिलीग्राम (1 देखें) 2 मिलीलीटर बड़ा एक रिक्त के लिए एक खाली ट्यूब छोड़ने फ्लास्क में. एसीटोन के 250 μl ट्यूब के तल पर कोशिका दीवार सामग्री इकट्ठा करने के साथ ट्यूब दीवारों कुल्ला, और एसीटोन airflow के तहत बहुत कोमल लुप्त हो जाना. धीरे ट्यूब दीवारों के साथ हौसले से बनाया एसिटाइल ब्रोमाइड के समाधान के 100 μl (25% v / v हिमनदों एसिटिक एसिड में एसिटाइल ब्रोमाइड) जोड़ने के लिए splashing रोकने के. कैप बड़ा फ्लास्क और 50 में गर्मी ° सी 2hrs के लिए हर 15 मिनट vortexing के साथ एक अतिरिक्त घंटे के लिए हीट. कमरे के तापमान पर बर्फ पर शांत. 2M सोडियम हीड्राकसीड और हौसले से तैयार 0.5 एम hydroxylamine हाइड्रोक्लोराइड के 70 μl के 400 μl जोड़ें. भंवर बड़ा बोतल. हिमनदों एसिटिक एसिड, टोपी के साथ बड़ा फ्लास्क वास्तव में 2.0 मिलीलीटर निशान भरें और मिश्रण करने के लिए कई बार पलटना. पिपेट एक यूवी विशिष्ट 96 अच्छी तरह से थाली में 200 समाधान के μl और 280nm पर एक एलिसा रीडर में पढ़ें. एसिटाइल ब्रोमाइड घुलनशील लिग्निन (% ABSL) का प्रतिशत निर्धारित एक उपयुक्त गुणांक का उपयोग कर (= चिनार 18.21, 17.75 = घास, Arabidopsis 15.69 =) निम्न सूत्र: % ABSL Calc: % ABSL सेल / स्नातकीय मिलीग्राम दीवार इकाई में 10 परिणामों के साथ गुणा यह करने के लिए मदद करता है कम से कम 3 थाली particulates absorbance के मूल्यों में मामूली बदलाव पैदा कर सकता है के बाद से absorbance (पेट) औसत पढ़ता है. नोट: 0.539 सेमी pathlength का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन थाली पर निर्भर करता है इस के लिए निर्धारित किया जा आवश्यकता हो सकती है. 3. Lignin संरचना रॉबिन्सन और Mansfield 5 द्वारा प्रकाशित हाल ही में एक विधि से इस विधि को अपनाया है. Thioacidolysis के लिए एक पेंच छाया ग्लास ट्यूब में कोशिका दीवार सामग्री के लगभग 2 मिलीग्राम (1 देखें.) स्थानांतरण. सावधानी से तैयार 2.5% बोरान trifluoride diethyl (3 BF) etherate, 10% ethanethiol समाधान (EtSH). आप एक नाइट्रोजन गैस से भरा गुब्बारा नाइट्रोजन के साथ dioxane बोतल में खो मात्रा विस्थापित उपयोग करना चाहिए. Dioxane बहुत खतरनाक है, नमूने या उपकरण डाकू के बाहर नहीं ले जाते. 20 μl EtSH; 5 μl बीएफ 3 175 μl dioxane: खंड नमूना प्रति समाधान की तैयारी के लिए की जरूरत है. EtSH, 3 BF, प्रत्येक नमूने के लिए dioxane समाधान के 200 μl जोड़ें . नाइट्रोजन गैस और टोपी तुरंत के साथ पर्ज शीशी headspace. 100 पर हीट ° सी कोमल मिश्रण हर घंटे के साथ 4 घंटे के लिए. 5 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करके अंत प्रतिक्रिया. 0.4M सोडियम बिकारबोनिट के 150 μl, भंवर जोड़ें के लिए स्वच्छ पानी की 1 मिलीग्राम और एथिल एसीटेट, भंवर के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने और चरणों को अलग चलो (तल पर शीर्ष पानी, पर एथिल एसीटेट). एक 2 मिलीलीटर Sarstedt ट्यूब में एथिल एसीटेट परत के 150 μl स्थानांतरण. सुनिश्चित करें कि कोई पानी स्थानांतरित कर रहा है. हवा के साथ एक concentrator द्वारा विलायक लुप्त हो जाना. 200 μl एसीटोन जोड़ें और लुप्त हो जाना (दो बार के एक कुल के लिए दोहराएँ अतिरिक्त पानी निकालने के लिए). टीएमएस derivatization के लिए एथिल एसीटेट के 500 μl, pyridine के 20 μl, और एन के 100 μl, हे – बीआईएस (trimethylsilyl) प्रत्येक ट्यूब करने के लिए acetamide जोड़ें. 25 में 2 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस जीसी / एमएस एक शीशी में प्रतिक्रिया के 100 μl स्थानांतरण और एसीटोन के 100 μl जोड़ने. एक quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर या लौ ionization डिटेक्टर के साथ सुसज्जित जीसी द्वारा नमूने का विश्लेषण. एक Agilent के HP – 5ms स्तंभ (30 एक्स 0.25 मिमी एक्स 0.25 सुक्ष्ममापी फिल्म मोटाई मिमी) स्थापित है. निम्न तापमान ढाल पर एक 30 मिनट विलायक और 1.1 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह दर देरी के साथ प्रयोग किया जाता है: 130 पर प्रारंभिक पकड़ ° सी, 3 मिनट के लिए एक 3 डिग्री सेल्सियस / मिनट 250 एक रैंप डिग्री सेल्सियस और 1 मिनट के लिए पकड़, की अनुमति 130 डिग्री सेल्सियस के प्रारंभिक तापमान के लिए संतुलन Peaks रिश्तेदार प्रतिधारण tetracosane आंतरिक मानक (वैकल्पिक) का उपयोग कर समय या 299 की विशेषता जन स्पेक्ट्रम आयनों के द्वारा पहचाने जाते हैं मी / z, 269 मीटर / z, और 239 मीटर / z के लिए एस, जी, एच और monomers, क्रमशः (चित्र देखें. 2). lignin घटकों की रचना कुल 100% करने के लिए चोटी के क्षेत्र की स्थापना के द्वारा मात्रा निर्धारित है 4. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 में एक दीवार के विश्लेषण का एक उदाहरण प्रस्तुत किया है. इस मामले में चिनार स्टेम (लकड़ी) प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लिखित विभिन्न प्रक्रियाओं द्वारा विश्लेषण किया गया था. Thioacidolysis और टीएमएस – derivatization बाद lignin घटकों की जुदाई का एक उदाहरण chromatogram दिखाया गया है. जाहिर है, के रिश्तेदार बहुतायत syringyl (एस), guaiacyl (G), और पी hydroxyphenol (एच) इकाइयों निर्धारित किया जा सकता है. एसिटाइल ब्रोमाइड घुलनशील लिग्निन की सामग्री आत्म व्याख्यात्मक है, एक दीवार सूखी वजन के 20-50% के बीच के मूल्यों की उम्मीद कर सकते हैं. एक नोट करना चाहिए कि एसिटाइल ब्रोमाइड दीवार में लिग्निन वर्तमान के सभी नहीं solubilize करता है और solubilization की डिग्री सामग्री पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकते हैं. हालांकि, इस पद्धति अपेक्षाकृत करने के लिए बाहर ले जाने के लिए आसान और तेजी से है और एक lignocellulosic सामग्री में lignin सामग्री का एक उत्कृष्ट सन्निकटन देता है. चित्रा 1: lignocellulosic विश्लेषण के अवलोकन सेल दीवारों (lignocellulosics) कच्चे सूखे पौधे सामग्री से अलग कर रहे हैं. दीवार सामग्री तो aliquots में भारित है और विभिन्न assays के लिए subdivided. दीवार सामग्री एसिटाइल ब्रोमाइड और यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मात्रा निर्धारित solubilized लिग्निन के साथ व्यवहार किया जाता है. Lignin संरचना के निर्धारण के लिए, दीवार सामग्री thioacidolysis के अधीन है. solubilized phenolics टीएमएस derivatization गुजरना और तो और अलग किया जा सकता है GC-एमएस विश्लेषण द्वारा मात्रा. मैट्रिक्स polysaccharide संरचना और क्रिस्टलीय सेलूलोज़ सामग्री प्रोटोकॉल 2 II भाग में चर्चा की है . चित्रा 2: चिनार की लकड़ी के व्यापक lignocellulosic विश्लेषण चिनार (Populus tremoloides) से लकड़ी के चिप्स वर्णित प्रोटोकॉल के अधीन थे. Ligin रचना, एच पी hydroxyphenyl, जी guaiacyl, एस syringyl इकाइयों.
Discussion
वर्णित विधियों lignin सामग्री और lignocellulosic बायोमास संयंत्र की रचना की एक तेजी से मात्रात्मक निर्धारण सक्षम है. IWall रोबोट का प्रयोग लगभग 350 नमूने और जमीन किया जा सकता है प्रति दिन तिरस्कृत. प्रति व्यक्ति विभिन्न विश्लेषणात्मक तरीकों के throughput बदलता रहता है. प्रोटोकॉल का प्रयोग यहाँ वर्णित, 30 नमूनों lignin सामग्री के लिए संसाधित किया जा सकता है, और lignin रचना के लिए प्रति दिन 15. डेटा इष्टतम फीडस्टॉक फसलों के मात्रात्मक प्रकृति के कारण, विविधता या जीनोटाइप जैव ईंधन के उत्पादन के लिए उनकी उपयुक्तता के मामले में मूल्यांकन किया जा सकता है.
Acknowledgements
हम उत्कृष्ट तकनीकी सेवा और जॉन, राल्फ मूल्यवान सलाह, चर्चा, और चिनार लकड़ी का नमूना के लिए विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय के लिए मैथ्यू रॉबर्ट Weatherhead के लिए आभारी हैं. यह काम अमेरिकी ऊर्जा विभाग (Doe) ग्रेट झील Bioenergy अनुसंधान केंद्र (विज्ञान डे FC02 – 07ER64494 डो BER कार्यालय) द्वारा और रसायन विज्ञान, Geosciences और बायोसाइंसेज प्रभाग, मूल ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय द्वारा विज्ञान के कार्यालय में वित्त पोषित किया गया था अमेरिकी ऊर्जा विभाग (पुरस्कार नहीं de-FG02-91ER20021).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Hydroxylamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 255580 | ||
| Acetyl Bromide | Aldrich | 135968 | ||
| Ethanethiol | Sigma-Aldrich | E3708 | ||
| Borontrifluoride diethyl etherate | Fluka | 15719 | ||
| N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide | Fluka | 15241 | ||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 296309 | ||
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | ||
| GC-MS | Agilent | 6890 GC/5975B MSD | (lignin composition) | |
| 5.5mm Stainless Steel Balls | Salem Ball Company | (N/A) | ||
| 96 well plate heat spreader | Biocision | Coolsink 96F | ||
| Heating block | Techne | Dri-block DB-3D | ||
| Sample concentrator | Techne | FSC400D |
References
- Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic Biofuels. Annual Review of Plant Biology. 60, 165-165 (2009).
- Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates. J Vis Exp. , (2010).
- Fukushima, R. S., Hatfield, R. D. Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method. J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133-3133 (2001).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).
- Robinson, A. R., Mansfield, S. D. Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling. Plant J. 58 (4), 706-706 (2009).
- Somerville, C. Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).
- Teeri, T. T., Brumer, H. Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases. Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).
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Compositional AnalysisPlant Cell WallsLignocellulosic BiomassLigninRenewable Raw MaterialsCarbon NeutralSustainableIndustrial Raw MaterialsLiquid FuelsBiocomposite MaterialsPlant BiomassCell WallsCelluloseHemicellulosesPolyphenol LigninRecalcitrantDegradationTensile StrengthPathogensWater TransportationStructural DiversityCrop SpeciesCrop VarietyBiorefinery Processing Steps
Cite This Article
Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin. J. Vis. Exp. (37), e1745, doi:10.3791/1745 (2010).