1. सेल वॉल अलगाव हवा या फ्रीज सूखे पौधे सामग्री के 60 70mg – मोटे तौर पर एक 2 मिलीलीटर Sarstedt पेंच टोपी एक iWall का उपयोग कर ट्यूब में 5.5 मिमी स्टेनलेस स्टील गेंदों के साथ पीस, एक पीस और वितरण रोबोट (30 s). एक वैकल्पिक गैर रोबोट कम throughput प्रक्रिया का उपयोग कर एक गेंद मिल (retschmill) द्वितीय भाग 2 में प्रस्तुत किया है . तिरस्कृत जमीन सामग्री, और अच्छी तरह भंवर में 70% के जलीय इथेनॉल के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें. 10 गोली न्यूनतम शराब अघुलनशील अवशेषों के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र. Aspirate या सतह पर तैरनेवाला छानना. / क्लोरोफॉर्म मेथनॉल (01:01 v / v) के अवशेषों का हल 1.5 मिलीलीटर जोड़ें और गोली resuspend ट्यूब अच्छी तरह हिला. 10 मिनट के लिए 10,000 rpm और सतह पर तैरनेवाला aspirate या छानना अपकेंद्रित्र. एसीटोन के 500 μl में Resuspend गोली. 35 पर हवा की एक धारा ° सी के साथ शुष्क जब तक विलायक लुप्त हो जाना. यदि जरूरत सूखे नमूने प्रसंस्करण आगे तक कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है है. नमूना से स्टार्च की हटाने को आरंभ करने के लिए एक 0.1 एम सोडियम एसीटेट बफर पीएच 5.0 की 1.5 मिलीलीटर में गोली resuspend. 20 मिनट के लिए Sarstedt ट्यूबों और गर्मी कैप. 80 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक में. बर्फ पर निलंबन अच्छा है. गोली निम्नलिखित एजेंट जोड़ें: 0.01% सोडियम azide (NaN3) के 35 μl, 35 μl (50 μg / एमएल एच 2 हे, सिग्मा, बेसिलस प्रजातियों से); amylase 17 μl pullulanase (बैसिलस acidopullulyticus से 17.8 इकाइयों, सिग्मा) . ट्यूब और अच्छी तरह भंवर कैप. निलंबन रात से अधिक 37 incubated ° सी प्रकार के बरतन में. Orienting ट्यूब क्षैतिज सहयोगियों मिश्रण में सुधार. हीट निलंबन पर 100 डिग्री सेल्सियस पाचन को समाप्त करने के लिए एक हीटिंग ब्लॉक में 10 मिनट के लिए. (10,000 rpm, 10 मिनट) अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला युक्त solubilized स्टार्च त्यागें. 1.5 मिलीलीटर पानी जोड़ने, vortexing, centrifuging, और धोने के पानी के decanting शेष गोली तीन बार धोएं. एसीटोन के 500 μl में Resuspend गोली. 35 पर हवा की एक धारा ° सी के साथ शुष्क जब तक विलायक लुप्त हो जाना. बेहतर सुखाने के लिए एक रंग के साथ सामग्री को तोड़ने ट्यूब में यह आवश्यक भी हो सकता है. सूखे सामग्री पृथक सेल दीवार (lignocellulosics) प्रस्तुत करता है. यदि जरूरत सूखे नमूने प्रसंस्करण आगे तक कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है है. 2. Lignin सामग्री इस विधि Fukushima और Hatfield 3 द्वारा एक रिपोर्ट पद्धति पर आधारित है. वजन 1 – तैयार कोशिका दीवार सामग्री के 1.5 मिलीग्राम (1 देखें) 2 मिलीलीटर बड़ा एक रिक्त के लिए एक खाली ट्यूब छोड़ने फ्लास्क में. एसीटोन के 250 μl ट्यूब के तल पर कोशिका दीवार सामग्री इकट्ठा करने के साथ ट्यूब दीवारों कुल्ला, और एसीटोन airflow के तहत बहुत कोमल लुप्त हो जाना. धीरे ट्यूब दीवारों के साथ हौसले से बनाया एसिटाइल ब्रोमाइड के समाधान के 100 μl (25% v / v हिमनदों एसिटिक एसिड में एसिटाइल ब्रोमाइड) जोड़ने के लिए splashing रोकने के. कैप बड़ा फ्लास्क और 50 में गर्मी ° सी 2hrs के लिए हर 15 मिनट vortexing के साथ एक अतिरिक्त घंटे के लिए हीट. कमरे के तापमान पर बर्फ पर शांत. 2M सोडियम हीड्राकसीड और हौसले से तैयार 0.5 एम hydroxylamine हाइड्रोक्लोराइड के 70 μl के 400 μl जोड़ें. भंवर बड़ा बोतल. हिमनदों एसिटिक एसिड, टोपी के साथ बड़ा फ्लास्क वास्तव में 2.0 मिलीलीटर निशान भरें और मिश्रण करने के लिए कई बार पलटना. पिपेट एक यूवी विशिष्ट 96 अच्छी तरह से थाली में 200 समाधान के μl और 280nm पर एक एलिसा रीडर में पढ़ें. एसिटाइल ब्रोमाइड घुलनशील लिग्निन (% ABSL) का प्रतिशत निर्धारित एक उपयुक्त गुणांक का उपयोग कर (= चिनार 18.21, 17.75 = घास, Arabidopsis 15.69 =) निम्न सूत्र: % ABSL Calc: % ABSL सेल / स्नातकीय मिलीग्राम दीवार इकाई में 10 परिणामों के साथ गुणा यह करने के लिए मदद करता है कम से कम 3 थाली particulates absorbance के मूल्यों में मामूली बदलाव पैदा कर सकता है के बाद से absorbance (पेट) औसत पढ़ता है. नोट: 0.539 सेमी pathlength का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन थाली पर निर्भर करता है इस के लिए निर्धारित किया जा आवश्यकता हो सकती है. 3. Lignin संरचना रॉबिन्सन और Mansfield 5 द्वारा प्रकाशित हाल ही में एक विधि से इस विधि को अपनाया है. Thioacidolysis के लिए एक पेंच छाया ग्लास ट्यूब में कोशिका दीवार सामग्री के लगभग 2 मिलीग्राम (1 देखें.) स्थानांतरण. सावधानी से तैयार 2.5% बोरान trifluoride diethyl (3 BF) etherate, 10% ethanethiol समाधान (EtSH). आप एक नाइट्रोजन गैस से भरा गुब्बारा नाइट्रोजन के साथ dioxane बोतल में खो मात्रा विस्थापित उपयोग करना चाहिए. Dioxane बहुत खतरनाक है, नमूने या उपकरण डाकू के बाहर नहीं ले जाते. 20 μl EtSH; 5 μl बीएफ 3 175 μl dioxane: खंड नमूना प्रति समाधान की तैयारी के लिए की जरूरत है. EtSH, 3 BF, प्रत्येक नमूने के लिए dioxane समाधान के 200 μl जोड़ें . नाइट्रोजन गैस और टोपी तुरंत के साथ पर्ज शीशी headspace. 100 पर हीट ° सी कोमल मिश्रण हर घंटे के साथ 4 घंटे के लिए. 5 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करके अंत प्रतिक्रिया. 0.4M सोडियम बिकारबोनिट के 150 μl, भंवर जोड़ें के लिए स्वच्छ पानी की 1 मिलीग्राम और एथिल एसीटेट, भंवर के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने और चरणों को अलग चलो (तल पर शीर्ष पानी, पर एथिल एसीटेट). एक 2 मिलीलीटर Sarstedt ट्यूब में एथिल एसीटेट परत के 150 μl स्थानांतरण. सुनिश्चित करें कि कोई पानी स्थानांतरित कर रहा है. हवा के साथ एक concentrator द्वारा विलायक लुप्त हो जाना. 200 μl एसीटोन जोड़ें और लुप्त हो जाना (दो बार के एक कुल के लिए दोहराएँ अतिरिक्त पानी निकालने के लिए). टीएमएस derivatization के लिए एथिल एसीटेट के 500 μl, pyridine के 20 μl, और एन के 100 μl, हे – बीआईएस (trimethylsilyl) प्रत्येक ट्यूब करने के लिए acetamide जोड़ें. 25 में 2 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस जीसी / एमएस एक शीशी में प्रतिक्रिया के 100 μl स्थानांतरण और एसीटोन के 100 μl जोड़ने. एक quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर या लौ ionization डिटेक्टर के साथ सुसज्जित जीसी द्वारा नमूने का विश्लेषण. एक Agilent के HP – 5ms स्तंभ (30 एक्स 0.25 मिमी एक्स 0.25 सुक्ष्ममापी फिल्म मोटाई मिमी) स्थापित है. निम्न तापमान ढाल पर एक 30 मिनट विलायक और 1.1 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह दर देरी के साथ प्रयोग किया जाता है: 130 पर प्रारंभिक पकड़ ° सी, 3 मिनट के लिए एक 3 डिग्री सेल्सियस / मिनट 250 एक रैंप डिग्री सेल्सियस और 1 मिनट के लिए पकड़, की अनुमति 130 डिग्री सेल्सियस के प्रारंभिक तापमान के लिए संतुलन Peaks रिश्तेदार प्रतिधारण tetracosane आंतरिक मानक (वैकल्पिक) का उपयोग कर समय या 299 की विशेषता जन स्पेक्ट्रम आयनों के द्वारा पहचाने जाते हैं मी / z, 269 मीटर / z, और 239 मीटर / z के लिए एस, जी, एच और monomers, क्रमशः (चित्र देखें. 2). lignin घटकों की रचना कुल 100% करने के लिए चोटी के क्षेत्र की स्थापना के द्वारा मात्रा निर्धारित है 4. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 में एक दीवार के विश्लेषण का एक उदाहरण प्रस्तुत किया है. इस मामले में चिनार स्टेम (लकड़ी) प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लिखित विभिन्न प्रक्रियाओं द्वारा विश्लेषण किया गया था. Thioacidolysis और टीएमएस – derivatization बाद lignin घटकों की जुदाई का एक उदाहरण chromatogram दिखाया गया है. जाहिर है, के रिश्तेदार बहुतायत syringyl (एस), guaiacyl (G), और पी hydroxyphenol (एच) इकाइयों निर्धारित किया जा सकता है. एसिटाइल ब्रोमाइड घुलनशील लिग्निन की सामग्री आत्म व्याख्यात्मक है, एक दीवार सूखी वजन के 20-50% के बीच के मूल्यों की उम्मीद कर सकते हैं. एक नोट करना चाहिए कि एसिटाइल ब्रोमाइड दीवार में लिग्निन वर्तमान के सभी नहीं solubilize करता है और solubilization की डिग्री सामग्री पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकते हैं. हालांकि, इस पद्धति अपेक्षाकृत करने के लिए बाहर ले जाने के लिए आसान और तेजी से है और एक lignocellulosic सामग्री में lignin सामग्री का एक उत्कृष्ट सन्निकटन देता है. चित्रा 1: lignocellulosic विश्लेषण के अवलोकन सेल दीवारों (lignocellulosics) कच्चे सूखे पौधे सामग्री से अलग कर रहे हैं. दीवार सामग्री तो aliquots में भारित है और विभिन्न assays के लिए subdivided. दीवार सामग्री एसिटाइल ब्रोमाइड और यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मात्रा निर्धारित solubilized लिग्निन के साथ व्यवहार किया जाता है. Lignin संरचना के निर्धारण के लिए, दीवार सामग्री thioacidolysis के अधीन है. solubilized phenolics टीएमएस derivatization गुजरना और तो और अलग किया जा सकता है GC-एमएस विश्लेषण द्वारा मात्रा. मैट्रिक्स polysaccharide संरचना और क्रिस्टलीय सेलूलोज़ सामग्री प्रोटोकॉल 2 II भाग में चर्चा की है . चित्रा 2: चिनार की लकड़ी के व्यापक lignocellulosic विश्लेषण चिनार (Populus tremoloides) से लकड़ी के चिप्स वर्णित प्रोटोकॉल के अधीन थे. Ligin रचना, एच पी hydroxyphenyl, जी guaiacyl, एस syringyl इकाइयों.