Summary
الكتلة الحيوية النباتية هي كبيرة خالية من الكربون الموارد المتجددة التي يمكن استخدامها لانتاج الوقود الحيوي. الكتلة الحيوية النباتية يتكون أساسا من جدران الخلايا ، والمواد المركبة المعقدة هيكليا ووصف lignocellulosics. نحن هنا وصف بروتوكول لإجراء تحليل شامل لمحتوى وتكوين اللجنين polyphenolic.
Abstract
أصبحت الحاجة للتجديد ومحايدة الكربون ، والمواد الخام اللازمة للصناعة مستدامة والمجتمع واحدة من القضايا الأكثر إلحاحا في القرن 21. وأعاد هذا الاهتمام في استخدام المنتجات النباتية والمواد الخام الصناعية لانتاج الوقود السائل للنقل
Protocol
1. خلية جدار العزل
- طحن ما يقرب من 60 70mg من الجو أو تجميد المجفف المواد النباتية 5.5 ملم مع كرات الفولاذ المقاوم للصدأ في 2 مل أنبوب Sarstedt سقف المسمار باستخدام iWall ، روبوت طحن وصرفها (30 ق). يتم تقديم بديل غير الروبوتية المنخفضة الإنتاجية الإجراء باستخدام الكرة مطحنة (retschmill) في الجزء الثاني 2.
- إضافة 1.5 مل من الايثانول المائي 70 ٪ إلى الاستغناء عن المواد الأرضية ، ودوامة بدقة.
- الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة لتكوير بقايا الكحول غير قابلة للذوبان.
- نضح أو صب وطاف.
- إضافة 1.5 مل من محلول الكلوروفورم / الميثانول (1:1 V / V) إلى بقايا ويهز جيدا لأنبوب resuspend الكرية.
- الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة ، ونضح أو صب وطاف.
- Resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من الأسيتون.
- يتبخر المذيب مع تيار من الهواء عند 35 درجة مئوية حتى يجف.
إذا كان يمكن تخزين العينات في درجة حرارة المجفف حاجة الغرفة حتى مزيد من المعالجة. - الشروع في إزالة النشا من العينة resuspend الكرية في 1.5 مل من الصوديوم 0.1 M 5.0 درجة الحموضة خلات العازلة.
- غطاء الأنابيب Sarstedt والحرارة لمدة 20 دقيقة. في 80 درجة مئوية في كتلة التدفئة.
- تبريد التعليق على الجليد.
- إضافة إلى العوامل التالية بيليه : 35 ميكرولتر من 0.01 ٪ أزيد الصوديوم (NaN3) ، 35 الأميليز ميكرولتر (50 ميكروغرام / مل H 2 O ؛ من الأنواع العصوية ، سيغما) ؛ pullulanase 17 ميكرولتر (17.8 حدات من acidopullulyticus العصوية ؛ سيجما) . غطاء الأنبوب ودوامة بدقة.
- والمحتضنة للتعليق أكثر من ليلة عند 37 درجة مئوية في شاكر. توجيه أنابيب تحسين مساعديه أفقيا الاختلاط.
- التعليق على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في كتلة التدفئة لإنهاء عملية الهضم.
- الطرد المركزي (10،000 دورة في الدقيقة ، 10 دقيقة) والتي تحتوي على نبذ طاف solubilized النشا.
- تغسل ما تبقى من بيليه ثلاث مرات عن طريق إضافة 1.5 مل من الماء ، vortexing ، الطرد المركزي ، والصب من مياه الغسيل.
- Resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من الأسيتون.
- يتبخر المذيب مع تيار من الهواء عند 35 درجة مئوية حتى يجف. قد يكون من الضروري أيضا لتفتيت المواد في الأنبوب مع ملعقة من أجل تحسين التجفيف.
المواد المجففة يعرض معزولة جدار الخلية (lignocellulosics). إذا كان يمكن تخزين العينات في درجة حرارة المجفف حاجة الغرفة حتى مزيد من المعالجة.
2. محتوى اللجنين
ويستند هذا الأسلوب على طريقة التي أبلغ عنها وفوكوشيما هاتفيلد 3.
- تزن 1-1،5 ملغ من مادة الخلية أعد الجدار (انظر 1) إلى 2 مل دورق حجمي ترك أنبوب واحد فارغة فارغة.
- شطف الجدران أنبوب مع 250 ميكرولتر من الأسيتون لجمع المواد جدار الخلية في أسفل الأنبوب ، وتتبخر والأسيتون لطيف جدا في ظل تدفق الهواء.
- إضافة بلطف 100 ميكرولتر من الطازجة حل بروميد الاسيتيل (25 ٪ V / V بروميد الاسيتيل في حامض الخليك الجليدي) على طول الجدران لمنع أنبوب الرش.
- غطاء القارورة الحجمية والحرارة عند 50 درجة مئوية لمدة 2hrs
- الحرارة لمدة ساعة إضافية مع vortexing كل 15 دقيقة.
- باردة على الجليد لدرجة حرارة الغرفة.
- إضافة 400 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 2M و 70 ميكرولتر من الطازجة 0.5 هيدروكلوريد هيدروكسيل M. دوامة القوارير الحجمية.
- تملأ القارورة الحجمية بالضبط علامة مل 2.0 مع حمض الخليك الجليدي ، وكأب وعكس عدة مرات لخلط.
- ماصة 200 ميكرولتر من الحل في لوحة فوق البنفسجية 96 محددة جيدا وقراءة في القارئ ELISA في 280nm.
- تحديد نسبة اللجنين بروميد الاسيتيل القابلة للذوبان (ABSL ٪) باستخدام معامل المناسب (الحور = 18.21 ؛ الأعشاب = 17.75 ؛ Arabidopsis = 15.69) مع الصيغة التالية :
٪ ABSL كالك :
تكاثر ABSL مع 10 ٪ في وحدة النتائج جدار الخلية ميكروغرام / مغ
فهي تساعد على قيام ما لا يقل عن 3 لوحة يقرأ لمتوسط الامتصاصية (ABS) منذ الجسيمات يمكن أن يسبب اختلاف طفيف في قيم الامتصاصية. ملاحظة : 0.539 سم يمثل طول المسار ، ولكن اعتمادا على لوحة هذا قد يكون من الضروري تحديدها.
3. تكوين اللجنين
يعتمد هذا الأسلوب من أسلوب حديث نشرته روبنسون ومانسفيلد 5.
- نقل حوالي 2 ملغ من المواد جدار الخلية (انظر 1) في أنبوب زجاجي المسمار توج لthioacidolysis.
- تعد بعناية ثلاثي فلوريد البورون 2.5 ٪ إثيل etherate (BF 3) ، و 10 ٪ ethanethiol (EtSH) حل. يجب عليك استخدام بالون مملوء غاز النيتروجين لتهجير حجم خسر في زجاجة ديوكسان مع النيتروجين. ديوكسان خطرة جدا ، لا تأخذ عينات من المعدات أو غطاء محرك السيارة. وحدات التخزين اللازمة لإعداد الحل لكل عينة : 175 ميكرولتر ديوكسان ؛ EtSH 20 ميكرولتر ؛ 5 ميكرولتر BF 3.
- إضافة 200 ميكرولتر من EtSH ، BF 3 ، ديوكسان حل لكل عينة.
- تطهير فراغ الرأس مع قارورة غاز النيتروجين وقبعة على الفور.
- الحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 4 ساعات مع كل طيف ساعة الاختلاط.
- رد فعل من قبل نهاية التبريد على الجليد لمدة 5 دقائق.
- إضافة 150 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم 0.4M ، الدوامة
- لتنظيف إضافة 1 مل من الماء و 0.5 مل من دوامة الإيثيلي ، خلات والسماح مراحل منفصلة (خلات الإيثيل على الماء ، على أعلى أسفل).
- نقل 150 ميكرولتر من طبقة خلات الإيثيل في أنبوب Sarstedt 2 مل. تأكد من عدم نقل أي المياه.
- تتبخر المذيبات من قبل المكثف مع الهواء.
- إضافة 200 ميكرولتر الأسيتون وتتبخر (تكرار لما مجموعه مرتين إزالة المياه الزائدة).
- لإضافة derivatization TMS 500 ميكرولتر من خلات الإيثيل ، 20 ميكرولتر من بيريدين ، و 100 ميكرولتر من N ، O - مكررا (trimethylsilyl) أسيتاميد لكل أنبوب.
- احتضان لمدة 2 ساعة عند 25 درجة مئوية.
- نقل 100 ميكرولتر من رد الفعل إلى قارورة GC / MS وإضافة 100 ميكرولتر من الأسيتون.
- تحليل العينات بواسطة GC مجهزة مطياف الكتلة رباعية أو لهب كاشف التأين. تم تثبيت HP - 5MS اجيلنت العمود (30 مم X 0.25 مم X 0.25 ميكرون فيلم سمك). يستخدم التدرج في درجة الحرارة التالية مع تأخير 30 دقيقة المذيبات ومعدل تدفق 1.1 مليلتر / دقيقة : عقد أول عند 130 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، لمدة 3 درجة مئوية / دقيقة المنحدر إلى 250 درجة مئوية وعقد لمدة 1 دقيقة ؛ تسمح موازنة مبدئية لدرجة حرارة 130 درجة مئوية
- ويتم تحديد أوقات الذروة التي الاحتفاظ به النسبية tetracosane الداخلية القياسية (اختياري) أو عن طريق خاصية الأيونات الطيف الكتلي من 299 م / ض ، و 269 م / ض ، و 239 م / ض ل S ، G ، H ، ومونومرات ، على التوالي (انظر الشكل. 2). كميا هو تكوين اللجنين عن طريق تحديد مكونات منطقة ذروة الإجمالي إلى 100 ٪
4. ممثل النتائج
ويقدم مثالا للتحليل الجدار في الشكل 2. في هذه الحالة تم تحليل الحور الجذعية (الخشب) من قبل مختلف الإجراءات المذكورة في المقطع البروتوكول. ويظهر على سبيل المثال chromatogram فصل اللجنين ، مكونات وبعد thioacidolysis TMS derivatization. بوضوح ، والوفرة النسبية للsyringyl - (S) ، guaiacyl - (G) ، و ف hydroxyphenol - (H) ويمكن تحديد وحدة. محتوى اللجنين بروميد الاسيتيل ذوبان غني عن البيان ، يمكن للمرء أن يتوقع من القيم بين 20-50 ٪ من الوزن الجاف الجدار. وينبغي للمرء أن يلاحظ أن بروميد الاسيتيل لا solubilize جميع الحاضرين اللجنين في الجدار ، وأنه على درجة من solubilization يمكن أن تختلف باختلاف المواد. ومع ذلك ، هذا الأسلوب هو السهل نسبيا لتنفيذ وسريع ويعطي تقريبي الممتاز لمحتوى اللجنين في مادة lignocellulosic.
يتم عزل الجدران نظرة عامة خلية التحليل lignocellulosic (lignocellulosics) من المواد النباتية الخام المجففة : الشكل 1. ومن المرجح ثم المادة الجدارية في aliquots وتقسيمها لفحوصات مختلفة. يتم التعامل مع المواد الجدار بروميد الاسيتيل واللجنين solubilized كميا بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. لتحديد تكوين اللجنين ، يخضع لمواد الجدار thioacidolysis. والفينولات solubilized الخضوع TMS derivatization وعندئذ يمكن فصلها وقياسها بواسطة GC - MS تحليل. وتناقش تشكيل السكاريد المصفوفة والسليلوز البلورية بروتوكول المحتوى في الجزء الثاني 2.
وتعرض رقائق الخشب lignocellulosic تحليل شامل من خشب الحور الحور (حور tremoloides) إلى البروتوكولات وصف : الشكل 2.
Ligin التكوين ؛ H - P hydroxyphenyl ؛ G guaiacyl ؛ S syringyl الوحدات.
Discussion
الأساليب المذكورة تمكين التقييم السريع الكمي لمحتوى اللجنين وتكوين الكتلة الحيوية النباتية lignocellulosic. ويمكن استخدام الروبوت iWall تكون الأرض حوالي 350 العينات والاستغناء يوميا. الإنتاجية من أساليب تحليلية مختلفة للشخص الواحد يختلف. باستخدام البروتوكولات وصفها هنا ، يمكن معالجة 30 عينات لمحتوى اللجنين ، و 15 للتكوين اللجنين في اليوم الواحد. نظرا لطبيعة كمية من المواد الوسيطة المحاصيل البيانات الأمثل ، يمكن تقييم أو المورثات متنوعة من حيث ملاءمتها لإنتاج الوقود الحيوي.
Acknowledgments
نحن ممتنون لماثيو روبرت يذرهيد للخدمة فنية ممتازة وجون رالف ، جامعة ويسكونسن للحصول على المشورة القيمة والمناقشات ، والحور الخشب العينة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الطاقة الأميركية (وزارة الطاقة) في منطقة البحيرات الكبرى مركز بحوث الطاقة الحيوية (وزارة الطاقة مكتب العلوم BER DE - 07ER64494 - FC02) ، والعلوم الكيميائية ، علوم الأرض والعلوم البيولوجية شعبة ، ومكتب للعلوم الأساسية للطاقة ، ومكتب للعلوم ، وزارة الطاقة الأميركية (أي تعويض. FG02 - DE - 91ER20021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 255580 | |
| Acetyl Bromide | Aldrich | 135968 | |
| Ethanethiol | Sigma-Aldrich | E3708 | |
| Borontrifluoride diethyl etherate | Fluka | 15719 | |
| N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide | Fluka | 15241 | |
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 296309 | |
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | |
| GC-MS | Agilent Technologies | 6890 GC/5975B MSD | (lignin composition) |
| 5.5mm Stainless Steel Balls | Salem Ball Company | (N/A) | |
| 96 well plate heat spreader | Biocision | Coolsink 96F | |
| Heating block | Techne | Dri-block DB-3D | |
| Sample concentrator | Techne | FSC400D |
References
- Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic Biofuels. Annual Review of Plant Biology. 60, 165-165 (2009).
- Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates. J Vis Exp. , (2010).
- Fukushima, R. S., Hatfield, R. D. Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method. J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133-3133 (2001).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).
- Robinson, A. R., Mansfield, S. D. Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling. Plant J. 58 (4), 706-706 (2009).
- Somerville, C. Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).
- Teeri, T. T., Brumer, H. Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases. Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).
