Улучшенный метод выделения РНК из Лоблолли Пайн ( П. taeda L.) и других хвойных пород
Summary
Многие ткани растений, в том числе флоэмы и ксилемы от ладанной сосны (<em> Pinus taeda</em> L.), содержат высокие уровни фенолов и полисахариды, которые мешают очистке РНК. В данной презентации обсуждаются методы для сбора полевых выращенные ткани и выделения РНК достаточного качества для микрочипов и другие анализы генома.
Abstract
Ткани изолированы от хвойных пород, особенно тех, кто принадлежит к семейству сосновых, таких как ладанной сосны (<em> Pinus taeda</em> L.), содержащих высокие концентрации фенольных соединений и полисахаридов, которые мешают очистке РНК. Выделение высококачественной РНК из этих видов требует строгих тканей процедуры сбора на местах и применение протокола РНК изоляции состоит из нескольких органических шагов добычи для того, чтобы изолировать РНК достаточного качества для микрочипов и других геномных анализов. Изоляции высококачественной РНК из полевых проб ладанной сосны может быть сложным, но некоторые изменения в стандартной ткани и процедуры РНК изоляции значительно улучшить результаты. Степени деградации общей РНК увеличивается, если образцы не правильно собраны и перевезены из области, особенно во время крупномасштабных урожаев. Всего дает РНК может быть значительно увеличено путем измельчения образцов в жидком азоте мельница морозильнике до РНК изоляции, особенно, когда выборки взяты из древесной ткани. Это в первую очередь из-за присутствии окислителей, таких как фенольные соединения и полисахариды, которые являются одновременно присутствовать на высоком уровне в экстрактах из древесных тканях большинства видов хвойных пород. Если не удалить эти загрязнения могут перенести, ведущие к проблемам, таким как деградация РНК, которые приводят к низкой урожайности и плохого качества РНК образца. Перенос фенольных соединений, а также полисахариды, также могут уменьшить или даже полностью устранить активность обратной транскриптазы или других полимераз обычно используется для синтеза кДНК. В частности, РНК, предназначенных для использования в качестве шаблона для двухцепочечной кДНК синтеза в поколение библиотек кДНК, одноцепочечной кДНК синтеза для ПЦР или КПЦР, или для синтеза микрочипов материалы цель должна быть самого высокого качества, если исследователи ожидают для получения оптимальных результатов. РНК изоляции методы, обычно используемые для многих других видов растений часто недостаточно в их способности, чтобы удалить эти загрязнения из хвойных образцов и, следовательно, не дают общую образцов РНК подходящие для последующих манипуляций. В этом видео мы продемонстрируем методы коллекции полей в тканях хвойных, начиная с вырубки сорок летнего дерева, уборка флоэмы, ксилемы вторичных и ксилемы реакции древесины. Мы также продемонстрировать протокол РНК изоляции, которая последовательно дали высококачественные РНК для последующего ферментативного манипуляций.
Protocol
Discussion
Получение высококачественной РНК из хвойных пород может быть трудной задачей, учитывая высокий уровень фенольных соединений и полисахаридов найден в древесных тканях. Начиная с протокол, разработанный Chang и соавт. (1), мы обнаружили, что более строгий добыче и очистке ступени ведут к по?…
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить следующих лиц без чьей помощи коллекции сосны ткани не было бы возможным: Доктор Джо Нэрн, Мэтт Брайман, Майкл Бордо, Ujwal Bagal, Huizhe Джин, и Аманда Буффье.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
