Summary

Un método mejorado para el aislamiento de ARN a partir de pino taeda ( P. taeda L.) y otras especies de coníferas

Published: February 22, 2010
doi:

Summary

Muchos tejidos de plantas, incluyendo el floema y el xilema de pino taeda (<em> Pinus taeda</em> L.), contienen altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos que interfieren con la purificación de ARN. Esta presentación se analizan las técnicas para la cosecha de tejidos cultivadas en el campo y el aislamiento de ARN de calidad suficiente para microarrays y otros análisis genómico.

Abstract

Tejidos aislados de especies de coníferas, en especial los que pertenecen a la familia Pinaceae, como el pino taeda (<em> Pinus taeda</em> L.), contienen altas concentraciones de compuestos fenólicos y polisacáridos que interfieren con la purificación de ARN. Aislamiento de ARN de alta calidad de estas especies requiere de rigurosos procedimientos de recogida de tejidos en el campo y el empleo de un protocolo de aislamiento de ARN consta de varios pasos de extracción orgánica con el fin de aislar el ARN de calidad suficiente para microarrays y otros análisis genómico. El aislamiento de ARN de alta calidad desde el campo las muestras recogidas pino de incienso puede ser un reto, pero varias modificaciones en los tejidos y los procedimientos estándar de aislamiento de ARN en gran medida a mejorar los resultados. El grado de general de la degradación del ARN aumenta si las muestras no están debidamente recogidos y transportados desde el campo, sobre todo en gran escala de las cosechas. Total de los rendimientos de ARN se puede aumentar de manera significativa por las muestras de pulverización en un molino de nitrógeno líquido antes de la congelación de aislamiento de ARN, especialmente cuando las muestras proceden de los tejidos leñosos. Esto se debe principalmente a la presencia de agentes oxidantes, como los compuestos fenólicos y polisacáridos que están presentes en altos niveles en los extractos de los tejidos leñosos de las especies más coníferas. Si no se elimina, estos contaminantes pueden llevar a más de los principales problemas, como la degradación del ARN, que se traducen en bajos rendimientos y una muestra de la mala calidad del ARN. El arrastre de los compuestos fenólicos, así como los polisacáridos, también puede reducir o incluso eliminar por completo la actividad de la transcriptasa inversa o polimerasas otros de uso común para la síntesis de cDNA. En particular, el ARN destinado a ser utilizado como molde para la doble cadena de síntesis de ADNc en la generación de bibliotecas de ADNc de una sola hebra de síntesis de ADNc por PCR o de PCR cuantitativa, o para la síntesis de materiales de destino de microarrays deben ser de la más alta calidad si los investigadores esperan que para obtener resultados óptimos. Técnicas de aislamiento de ARN comúnmente empleados para muchas especies de plantas son a menudo insuficientes en su capacidad para eliminar estos contaminantes a partir de muestras de coníferas y por lo tanto no dan muestras de ARN total adecuado para manipulaciones posteriores. En este video se demuestra métodos para la recogida de campo de los tejidos de coníferas, a partir de la tala de un cuarenta años de edad del árbol, para la recolección de floema, xilema secundario y xilema madera de reacción. También demuestran un protocolo de aislamiento de ARN que siempre ha dado de alta calidad del ARN para su posterior manipulación enzimática.

Protocol

Parte 1: Cosecha de árboles Después de que el árbol se selecciona y se cortan, es importante trabajar con cuidado y lo más rápidamente posible. Como cada tipo de tejido diferentes se cosecha, se deben colocar inmediatamente en sus propios barcos de nitrógeno líquido para evitar la contaminación cruzada de muestras. Este protocolo de aislamiento de ARN es escalable. Cortar los pernos en longitudes de aproximadamente 0,5-0,75 m y con una puntuación de motosierra de…

Discussion

La obtención de ARN de alta calidad a partir de especies de coníferas puede ser una tarea difícil debido a los altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos se encuentran en los tejidos leñosos. Comenzando con el protocolo desarrollado por Chang et al. (1), hemos encontrado que la extracción de más riguroso y limpieza de los pasos conducen al aislamiento constante de muy alta calidad total de ARN de varios tejidos leñosos no maderables en la muestra de una gran variedad de especies de coníferas. Este v…

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a las siguientes personas, sin cuya ayuda la colección de tejidos de pino, no habría sido posible: el Dr. Joe Nairn, Bryman Matt, Michael Burdeos, Bagal Ujwal, Jin Huizhe y Bouffier Amanda.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
RNA Isolation Buffer       2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform   Fisher Scientific C298-4  
Phenol, Ultrapure   Invitrogen 15509-037  
10M LiCl       Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer       1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8       Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0)       120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes   Thermo-Fisher #05-562-16B  
Polypropylene 50mL High Speed Tubes   Thermo-Fisher #05-562-10K  
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes   VWR #21008-939  
Phase Lock Gel Heavy, 2mL   Thermo-Fisher #2302830  
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL   Ambion, Inc. #AM12425  

References

  1. Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
  2. Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).

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Cite This Article
Lorenz, W. W., Yu, Y., Dean, J. F. D. An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species. J. Vis. Exp. (36), e1751, doi:10.3791/1751 (2010).

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