Un método mejorado para el aislamiento de ARN a partir de pino taeda ( P. taeda L.) y otras especies de coníferas
Summary
Muchos tejidos de plantas, incluyendo el floema y el xilema de pino taeda (<em> Pinus taeda</em> L.), contienen altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos que interfieren con la purificación de ARN. Esta presentación se analizan las técnicas para la cosecha de tejidos cultivadas en el campo y el aislamiento de ARN de calidad suficiente para microarrays y otros análisis genómico.
Abstract
Tejidos aislados de especies de coníferas, en especial los que pertenecen a la familia Pinaceae, como el pino taeda (<em> Pinus taeda</em> L.), contienen altas concentraciones de compuestos fenólicos y polisacáridos que interfieren con la purificación de ARN. Aislamiento de ARN de alta calidad de estas especies requiere de rigurosos procedimientos de recogida de tejidos en el campo y el empleo de un protocolo de aislamiento de ARN consta de varios pasos de extracción orgánica con el fin de aislar el ARN de calidad suficiente para microarrays y otros análisis genómico. El aislamiento de ARN de alta calidad desde el campo las muestras recogidas pino de incienso puede ser un reto, pero varias modificaciones en los tejidos y los procedimientos estándar de aislamiento de ARN en gran medida a mejorar los resultados. El grado de general de la degradación del ARN aumenta si las muestras no están debidamente recogidos y transportados desde el campo, sobre todo en gran escala de las cosechas. Total de los rendimientos de ARN se puede aumentar de manera significativa por las muestras de pulverización en un molino de nitrógeno líquido antes de la congelación de aislamiento de ARN, especialmente cuando las muestras proceden de los tejidos leñosos. Esto se debe principalmente a la presencia de agentes oxidantes, como los compuestos fenólicos y polisacáridos que están presentes en altos niveles en los extractos de los tejidos leñosos de las especies más coníferas. Si no se elimina, estos contaminantes pueden llevar a más de los principales problemas, como la degradación del ARN, que se traducen en bajos rendimientos y una muestra de la mala calidad del ARN. El arrastre de los compuestos fenólicos, así como los polisacáridos, también puede reducir o incluso eliminar por completo la actividad de la transcriptasa inversa o polimerasas otros de uso común para la síntesis de cDNA. En particular, el ARN destinado a ser utilizado como molde para la doble cadena de síntesis de ADNc en la generación de bibliotecas de ADNc de una sola hebra de síntesis de ADNc por PCR o de PCR cuantitativa, o para la síntesis de materiales de destino de microarrays deben ser de la más alta calidad si los investigadores esperan que para obtener resultados óptimos. Técnicas de aislamiento de ARN comúnmente empleados para muchas especies de plantas son a menudo insuficientes en su capacidad para eliminar estos contaminantes a partir de muestras de coníferas y por lo tanto no dan muestras de ARN total adecuado para manipulaciones posteriores. En este video se demuestra métodos para la recogida de campo de los tejidos de coníferas, a partir de la tala de un cuarenta años de edad del árbol, para la recolección de floema, xilema secundario y xilema madera de reacción. También demuestran un protocolo de aislamiento de ARN que siempre ha dado de alta calidad del ARN para su posterior manipulación enzimática.
Protocol
Discussion
La obtención de ARN de alta calidad a partir de especies de coníferas puede ser una tarea difícil debido a los altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos se encuentran en los tejidos leñosos. Comenzando con el protocolo desarrollado por Chang et al. (1), hemos encontrado que la extracción de más riguroso y limpieza de los pasos conducen al aislamiento constante de muy alta calidad total de ARN de varios tejidos leñosos no maderables en la muestra de una gran variedad de especies de coníferas. Este v…
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a las siguientes personas, sin cuya ayuda la colección de tejidos de pino, no habría sido posible: el Dr. Joe Nairn, Bryman Matt, Michael Burdeos, Bagal Ujwal, Jin Huizhe y Bouffier Amanda.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
