Summary
Il labirinto Lashley III è un percorso di apprendimento-lavoro che non si basa su stimoli avversi o segnali visivi. E 'quindi una scelta molto attraente per la valutazione dell'apprendimento e della memoria, soprattutto nei topi l'invecchiamento o in altro modo in cui lo stress è una considerazione.
Abstract
Molti test comportamento progettato per valutare l'apprendimento e la memoria nei roditori, soprattutto topi, si basano su segnali visivi, la privazione del cibo e / o acqua, o altri stimoli avversi per motivare l'acquisizione delle attività. L'età degli animali, modalità sensoriali deteriorarsi. Per esempio, molti ceppi di topi sviluppano deficit dell'udito o cataratta. Cambiamenti nei sistemi sensoriali necessari per guidare topi durante l'acquisizione compito attuale confonde potenziale di interpretare i cambiamenti di apprendimento negli animali invecchiamento. Inoltre, l'utilizzo di stimoli avversi per motivare gli animali per imparare attività è potenzialmente confondenti quando si confrontano i topi con sensibilità differenziale allo stress. Per minimizzare questo tipo di effetti confondenti, abbiamo implementato una versione modificata del labirinto Lashley III. Questo labirinto si basa sul percorso di apprendimento, in cui i topi imparare a navigare in un labirinto attraverso l'esposizione ripetuta in condizioni di basso stress, ad esempio fase buia, senza cibo / acqua, privazioni, fino a che non navigare in un percorso dalla posizione iniziale di una pseudo-casa gabbia con 0 o 1 errore (s) su due prove consecutive. Noi classificare questo come un basso stress test comportamento, perché non si basa su stimoli avversi per incoraggiare l'esplorazione del labirinto e di apprendimento del compito. L'apparecchio è costituito da una scatola di inizio modulare, un 4-corpo braccio labirinto, e una scatola obiettivo. Alla fine della scatola obiettivo è quello di una pseudo-casa gabbia che contiene letto simile a quello trovato nella gabbia casa dell'animale ed è specifico per ogni animale per la durata della prova labirinto. E 'stato dimostrato in precedenza che questo pseudo-casa gabbia offre ricompensa sufficiente per motivare i topi per imparare a navigare nel labirinto
Protocol
1. Preparazione:
- Il labirinto Lashley III è costruito in plexiglass ed è illustrato nella figura 1. La casella di partenza, le braccia labirinto, e la scatola obiettivo sono modulari per consentire la pulizia e la modificabilità del labirinto. Le pareti della piazzola di partenza, le braccia labirinto, e la scatola obiettivo sono realizzati in plexiglas nero per eliminare i segnali visivi da fuori e dentro il labirinto. Braccia labirinto sono 45 cm di lunghezza, 7 cm di altezza e 5 cm di larghezza. Porte che conducono alle armi consecutive del labirinto sono 4 cm x 4 cm e si trova a 11 cm dalle pareti esterne del labirinto. La scatola obiettivo è di 19.5 cm di lunghezza x 7 cm x 5 cm di larghezza. La casella di partenza è di 8 cm x 9.5 cm x 7 cm. Separare i pezzi di plexiglas trasparente sono posizionati sulla parte superiore della finestra di avvio, il labirinto, e la scatola obiettivo di permettere la visualizzazione di ogni mouse mentre progredisce attraverso il labirinto evitando i topi di fuggire. Il labirinto poggia su una base costruita su plexiglas rosso che è abbastanza grande da contenere i tre pezzi del labirinto e una pseudo-casa gabbia che è la dimensione stessa gabbia casa normale dell'animale.
- Per preparare pseudo-casa gabbie prima del processo primo labirinto, una lettiera fresca dello stesso tipo di quello usato in gabbie a casa gli animali 'è aggiunto al fondo gabbia individuo che ha le porte (2 cm x 2 cm) tagliato in entrambi i lati. Filo posto cime su questi fondali gabbia e individualmente numero di loro, uno per ogni animale in una coorte di prova. Queste gabbie servirà come singoli pseudo-casa gabbie per ogni animale per tutta la durata del periodo di prova. Perché stiamo studiando il ruolo dello stress e / o ansia comportamenti correlati nell'apprendimento e nella memoria, usiamo pseudo-casa gabbie per evitare individualmente ospitano topi nelle loro gabbie casa. Tuttavia, se tali fattori non sono di primaria importanza, gli animali possono essere ospitati singolarmente in gabbie modificate casa con porte e queste gabbie possono servire come le gabbie a casa per la navigazione labirinto di successo.
2. Test:
- Ogni giorno, gli animali vengono spostati nella sala prove il comportamento di un minimo di un'ora prima del test per permettere loro di acclimatarsi all'ambiente di test.
- Trenta minuti prima della prova, avviate tempo, il cibo e l'acqua viene rimossa da tutte le gabbie a casa. Mantenere il cibo e l'acqua nella sala prove comportamento, ma fuori dalla portata dei topi. Cibo e acqua è generalmente rimossa 30 minuti dopo il cambiamento dalla fase di luce per la fase di buio, dopo l'allattamento picco si è verificato. Questo assicura che gli animali sono per lo più cibo e acqua-sazi prima del test, tuttavia, i test in questo periodo offre un piccolo ulteriore forza motivante per navigare nel labirinto, anche se non c'è cibo palese o premiare l'acqua al termine delle attività.
- Dopo il periodo di 30 minuti pre-test è trascorso, pulire il labirinto con il 70% di etanolo. Lasciare la porta che dalla finestra di avvio nel labirinto braccia chiuse. Le porte ad entrambe le estremità della scatola obiettivo vengono lasciate aperte.
- Posizionare la pseudo-casa gabbia corrispondente al primo animale, alla fine della scatola obiettivo.
- Portare il primo mouse al labirinto, coppettazione in mano. Mettere il mouse nella casella di partenza e sostituire il coperchio.
- Quando in grado di rispettare il labirinto senza ostacoli, aprire la porta casella di inizio e iniziare subito tre cronometri.
- Quando tutte e quattro le zampe del topo hanno lasciato la finestra di avvio, chiudere la porta casella avviare e interrompere il timer prima.
- Record a mano il percorso con il mouse viaggia come naviga il labirinto. Un mouse entra in una nuova zona o il braccio del labirinto in cui tutte e quattro le zampe hanno attraversato in quella zona (vedi fig. 1).
- Quando tutte e quattro le zampe entrare nella casella scopo, chiudere la porta che conduce tra il labirinto e la scatola porta e fermare la seconda cronometro.
- Quando il mouse è completamente entrato nella pseudo-casa gabbia, chiudere la porta tra la casella di obiettivo e la gabbia. Fermare il terzo cronometro.
- Registra i tempi dei tre cronometri. Contare il numero di errori il mouse ha fatto. Un errore è definito come un entrata in un vicolo cieco cul-de-sac zona (ad esempio, passando da L braccio alla zona K;. Fig. 1) o un viaggio indietro attraverso un percorso già braccio del labirinto (per esempio, passando da F braccio a braccio C, Fig. 1).. Mentre punteggio di prestazione del mouse come sta avvenendo, è possibile videocassetta o comunque prove labirinto di registrazione per consentire il punteggio conseguente sia ad occhio nudo o da software automatici. Discrezione sperimentatore dovrebbe essere usato per scegliere un metodo appropriato.
- Lasciare l'animale in gabbia pseudo-casa per 1 minuto prima di tornare alla sua gabbia casa.
- Ripetere i passaggi 2,3-2,12 per tutti i mouse nella coorte di test.
- Quando il mouse ultimo della coorte è stato restituito alla sua gabbia casa, avviare il timer 30 min. Al termine di questo periodo 30 minuti, ritorno cibo e acqua per tutti i mouse nella coorte e poi tornare gli animali nella loro stanza colonia.
- Ripetere questa procedura in notti consecutive, con una sola prova per test giorno per animale, fino a quando tutti i topi nella coorte hanno raggiunto un criterio definito apprendimento o fino a n predeterminatoumero di prove di test si è verificato. Un mouse è classificato come aver imparato il labirinto in cui è possibile eseguire l'operazione con 0 o 1 errore (s) su due prove consecutive. I topi sono testati nello stesso ordine sulle sperimentazioni successive.
3. Rappresentante dei risultati:
Giorni di tempo per imparare (raggiungere criterio) può essere analizzati e confrontati tra i diversi gruppi in uno studio particolare (Fig. 2A e 3A). Inoltre, un indice di apprendimento (learning ratio), che caratterizza l'acquisizione labirinto, può essere valutata nei primi quattro giorni del periodo di prova (Fig. 2B e 3B). L'indice di apprendimento è il rapporto tra il numero di segmenti di percorso corretto percorso per il numero totale di segmenti del tragitto percorso per ogni prova. L'indice di apprendimento medio dovrebbe essere di circa 0,5 per il processo 1, quando i topi vengono prima esposte al labirinto e la navigazione per caso. Gli aumenti indice di apprendimento e approcci 1 tra 2 e 4 prove che indicano che l'apprendimento si sta verificando. Nella figura 2, i giovani (2 mesi) e l'invecchiamento (24 mo) C57Bl/6NCr topi maschi sono stati formati sul labirinto Lashley per un massimo di 15 prove. I topi giovani imparato il labirinto a 7.2 (± 1.5) d. Al contrario, gli animali di invecchiamento ha 11,7 (± 2,1) d per raggiungere criterio. C'è stata una forte tendenza per i topi C57Bl/6NCr invecchiamento richiedere più tempo per imparare il labirinto ([t (23) = 1.59, P = 0,056]; una coda t-test, una ipotesi a priori che i giorni per imparare è più in età topi). Quando l'indice di apprendimento è calcolato, entrambi i gruppi di età mostrano un costante aumento l'indice di apprendimento da studi 2 a 4 (significativo effetto principale del tempo P <0,001). Tuttavia, non vi erano differenze statisticamente significative nell'indice di apprendimento tra giovani e vecchi topi C57 C57 topi (effetto principale di età P = 0,58).
Figura 3 è rappresentativo di studi che hanno esaminato gli effetti di tensione di fondo per l'apprendimento del comportamento. I dati del C57Bl/6NCr giovani maschi mostrato in fig. 2 sono ora rispetto ai dati da giovani Crl: CD-1 (ICR) BR topi [CD-1, 4-5 mo]. CD-1 nei topi imparato il labirinto Lashley III a 4.5 (± 1.4) d, tuttavia, non vi era alcuna differenza significativa tra i ceppi in giorni per imparare (Fig. 3A; [t (18) = 1,328, p = 0,20], due coda t-test). Al contrario, l'esame degli spettacoli indice di apprendimento che, mentre tutti gli animali sono stati navigare il labirinto sul primo processo per caso, topi CD-1 imparato il compito più velocemente (effetto principale del ceppo P <0,001). Ciò è dimostrato dal l'aumento statisticamente significativo l'indice di apprendimento nel corso degli studi da 2 a 4 in CD-1 nei topi rispetto ai topi C57Bl/6NCr. È interessante notare che se i topi CD-1 continuano ad essere addestrati nei meandri oltre il punto di raggiungere criterio, che mostrano un comportamento indicativo di sovrallenamento (Fig. 4), che viene discusso in dettaglio più avanti.
Figura 1:. Il labirinto Lashley III Il vicolo cieco cul-de-sac zone del labirinto sono di colore rosso in questo diagramma ha scopi puramente illustrativi. La base e le braccia del labirinto reali sono colori solidi (nel riquadro). Il labirinto è in scala (dimensioni in testo).
Figura 2: Lashley prestazioni labirinto III in 2 e 24 mesi i topi maschi C57Bl/6NCr Il labirinto Lashley III è stato utilizzato per valutare percorso di apprendimento nei giovani (2 mesi) e l'invecchiamento (24 mo) C57Bl/6NCr topi maschi.. I parametri misurati sono stati (a) giorni di tempo per criterio, il numero di giorni necessari per un mouse per eseguire il labirinto per due notti consecutive con 0 errori o 1 errore, e (b) indice di apprendimento, il numero corretto di quattro zampa voci braccio fatto rispetto al numero totale di voci braccio realizzato nei giorni 1-4 di test Lashley labirinto III. Numero di animali per ogni gruppo sono stati n = 10 per 2 mesi e n = 15 per 24 mesi i topi.
Figura 3: Lashley prestazioni labirinto III C57Bl/6NCr nei giovani maschi e CD-1 nei topi Il labirinto Lashley III è stato utilizzato per valutare percorso di apprendimento in 2 mesi C57Bl/6NCr e 4-5 mesi topi CD-1.. I parametri misurati sono stati (a) giorni di tempo per criterio, il numero di giorni necessari per un mouse per eseguire il labirinto per due notti consecutive con 0 errori o 1 errore, e (b) indice di apprendimento, il numero corretto di quattro zampa voci braccio fatto rispetto al numero totale di voci braccio realizzato nei giorni 1-4 di test Lashley labirinto III. Numero di animali per ogni gruppo sono stati n = 10 per C57Bl/6NCr e n = 10 per i CD-1 nei topi. Significati statistici: * p <0.05, ** P <0,01 rispetto ai topi C57Bl/6NCr.
Figura 4: Lashley prestazioni labirinto III in 4-5 mesi maschio CD-1 nei topi Il labirinto Lashley III.stato utilizzato per valutare percorso di apprendimento in dieci 4-5 mesi maschio topi CD-1 su 15 giorni consecutivi. I parametri misurati sono stati (a), numero di errori commessi al giorno, con un errore definito come un quattro zampa entrata in un vicolo cieco cul-de-sac zona o in viaggio uno già viaggiato braccio del labirinto, e (b) tempo trascorso nel labirinto al giorno. Il giorno in cui è stata raggiunta criterio è indicato con una freccia rossa.
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Discussion
I test sui roditori più usati comportamentali per valutare l'apprendimento e la memoria sono il labirinto ad acqua di Morris e varianti di condizionamento alla paura 2. Questi test si basano su segnali visivi o uditivi per l'apprendimento e stimoli avversi (ad esempio, acqua, footshock) per motivare gli animali per completare i compiti 3. Nei roditori invecchiamento, come nell'uomo l'invecchiamento, modalità sensoriali declino nel tempo. Ceppi diversi di topi sfondo perdono l'udito o sviluppare cataratte con l'età, e dei tassi di mortalità dopo 23,5 ore di privazione di acqua hanno dimostrato di aumentare nei topi come 4 anni. Così, i cambiamenti nelle prestazioni in questi test più ampiamente utilizzati possono essere difficili da interpretare nei roditori invecchiamento.
Il labirinto Lashley III è stato descritto da Karl Lashley nel 1929 5. Lashley usato questo paradigma per cercare l'engram memoria nella corteccia utilizzando tecniche lesione corticale. Abbiamo leggermente modificato il labirinto originale per permettere la sua vasta applicabilità di studi che coinvolgono roditori invecchiamento. Abbiamo eliminato alimentare cued navigazione del labirinto e hanno dimostrato che uno pseudo-ambiente domestico gabbia fornisce una motivazione sufficiente a topi, sia giovani e anziani per navigare nel labirinto 1. Altri ricercatori hanno utilizzato una ricompensa alimentare pellet per facilitare l'apprendimento del labirinto Lashley III 7. Visivamente-cued di navigazione, come quello richiesto nel labirinto ad acqua di Morris e il labirinto Barnes circolare, è stata minimizzata 2,6,8. I topi non sono cibo privati al 90% del loro peso corporeo, in quanto è necessario per diverse varianti del labirinto radiali, Y-labirinto e T-labirinto compiti 2,9-10. Piuttosto, il cibo e l'acqua è disponibile per gli animali ad libitum e viene rimosso solo 30 minuti prima di ogni prova di test con i test di solito si svolgono durante la fase attiva buio. Il cibo è tornato 30 minuti dopo l'ultima del mouse in una coorte ha completato il compito e si dissocia temporalmente dal ritorno alla pseudo-casa gabbia in modo da non agire come un premio aperto per il completamento del compito. Importante, indisponibilità di cibo e acqua per l'intera coorte non dovrebbero estendersi oltre un periodo di 4-5 ore per prova. Inoltre, i topi che rappresentano diversi gruppi sperimentali devono essere testati insieme sulle stesse notti.
La modularità del labirinto Lashley III permette di modifiche destinate a testare diversi aspetti dell'apprendimento ritenzione. Per esempio, mentre acquisition si verifica con il labirinto in una configurazione specifica, una volta acquisizione è established, il labirinto può essere ruotata in modo che i topi devono girare in senso opposto per completare il compito, cioè topi svoltare a destra uscendo dalla piazzola di partenza per navigare con successo il labirinto durante l'acquisizione, ma la flessibilità di apprendimento (richiamo) può essere misurata ruotando il labirinto in modo che i topi devono svoltare a sinistra, fuori dalla scatola di partenza per la navigazione di successo. Ulteriori variazioni della procedura di test includono la creazione di apprendimento per un determinato periodo di tempo (solitamente 14 giorni) e poi consente un intervallo di ritardo di alcune settimane dopo che la ritenzione di apprendimento labirinto si misura. Intervalli di ritenzione devono essere stabiliti dal lavoro pilota e sono study-/strain-dependent. Sessioni di allenamento più tendono ad essere associati con intervalli temporali più lunghi. Le modifiche del labirinto Lashley III procedura stessa includono l'aggiunta di spunti odore o stimoli rumore per fornire ulteriore motivazione per la navigazione labirinto di successo. Fattori di stress come lo stress contenzione può essere applicato in tempi diversi prima, durante o dopo l'acquisizione di indagare dipendenti dallo stato di apprendimento e memoria.
Un fattore importante da considerare in sede di attuazione il labirinto Lashley III è la durata dell'intervallo di formazione. La maggior parte dei ceppi di topi inbred disponibili e outbred, tra C57BL / 6, Svizzera Webster, e BXD ricombinante topi inbred, raggiungerà il criterio di apprendimento entro 14 giorni. Alcuni ceppi, in particolare topi CD-1, raggiunge criterio dopo soli 7 giorni. Sovrallenamento di alcuni ceppi di topi produce un comportamento aberrante nel labirinto, i topi in cui inizierà a mostrare una crescita costante e rapido aumento del numero degli errori commessi per prova e il tempo trascorso esplorare il labirinto. Figura 4 è rappresentativo di sovrallenamento in 4-5 mesi maschio CD-1 nei topi. Dopo la prima esposizione al labirinto, abbiamo istituire un 15 minuti di cut-off per periodo di prova per ogni mouse. Dopo 15 minuti, il mouse è condotto attraverso il labirinto di pseudo-casa gabbia e gli errori non vengono conteggiati una volta che la tacca dei 15 minuti è stato raggiunto. Se alcuni topi in una coorte o in uno studio più ampio bisogno di essere guidati attraverso il labirinto dopo aver raggiunto i criteri di apprendimento, questo può essere indicativo di sovrallenamento. Per aggirare i problemi con il sovrallenamento e di ridurre la durata complessiva di test, abbiamo limitato la fase di acquisizione di quattro prove in alcuni studi e in media l'indice di imparare dai processi terza e la quarta per determinare un punteggio di apprendimento. Questo punteggio di apprendimento può essere paragonato al posto digiorni di tempo per imparare.
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Disclosures
Tutti i protocolli di comportamento sono stati approvati dalla cura degli animali Pennsylvania State University e del Comitato Istituzionale Usa. Non ci sono informazioni finanziarie da segnalare.
Acknowledgments
Il labirinto Lashley III utilizzate per questi esperimenti è stato costruito da Tim Bowmaster, Paolo Corman, Barry Dutrow, Ryan Jabco, e Tim Treaster dalla Pennsylvania State Macchina Negozio Dipartimento di Fisica dell'Università. Gli autori desiderano ringraziare la signora Shoba Belegundu, la signora Tara Chrzanowski, e la signora Alexandra Lewis per l'assistenza nello svolgimento degli esperimenti presentati nelle Figure 2-4. Walter Jackson fornito un feedback prezioso per la preparazione di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institute of Mental Health (MH064756 e MH077978 di AMA). I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute of Mental Health e il National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lashley III maze | PSU Physics Machine Shop | N/A | Maze must be custom-built, not commercially available |
References
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