Summary
Le labyrinthe de Lashley III est une tâche itinéraire d'apprentissage qui ne repose pas sur des stimuli aversifs ou des indices visuels. C'est donc une option très intéressante pour évaluer l'apprentissage et la mémoire, en particulier dans les souris vieillissantes ou autrement, où le stress est une considération.
Abstract
Beaucoup de tests de comportement visant à évaluer l'apprentissage et la mémoire chez les rongeurs, en particulier les souris, s'appuient sur des repères visuels, la privation de nourriture et / ou de l'eau, ou d'autres stimuli aversifs pour motiver l'acquisition tâche. Comme l'âge des animaux, des modalités sensorielles se détériorer. Par exemple, de nombreuses souches de souris développent l'audition des déficits ou des cataractes. Les changements dans les systèmes sensoriels nécessaires pour guider les souris lors de l'acquisition tâche actuelle confond potentiel dans l'interprétation des variations d'apprentissage chez les animaux vieillissants. Par ailleurs, l'utilisation de stimuli aversifs pour motiver les animaux à apprendre des tâches est potentiellement confondants en comparant des souris avec différentes sensibilités au stress. Pour minimiser ces types d'effets confondants, nous avons implémenté une version modifiée du labyrinthe Lashley III. Ce dédale d'apprentissage repose sur la route, où les souris apprennent à naviguer dans un labyrinthe à travers une exposition répétée dans des conditions de stress faible, par exemple la phase sombre, pas de privation de nourriture / eau, jusqu'à ce qu'ils naviguer sur un chemin de l'emplacement de début à une cage de pseudo-maison avec 0 ou 1 erreur (s) sur deux essais consécutifs. Nous classons cela comme un test de comportement à faible stress, car il ne repose pas sur des stimuli aversifs d'encourager l'exploration du labyrinthe et de l'apprentissage de la tâche. L'appareil se compose d'une boîte de démarrage modulaire, un organe labyrinthe 4-bras, et une boîte de but. A la fin de la boîte de but est une cage de pseudo-maison qui contient la literie semblable à celle trouvée dans la cage de la maison de l'animal et est spécifique à chaque animal pour la durée du test labyrinthe. Il a été démontré précédemment que cette cage pseudo-home offre une récompense suffisante pour motiver les souris pour apprendre à naviguer dans le labyrinthe
Protocol
1. Préparation:
- Le labyrinthe est construit Lashley III de plexiglas et est représenté dans la figure 1. La zone de départ, les bras labyrinthe, et la boîte de but sont modulaires pour permettre le nettoyage et la modifiabilité du labyrinthe. Les murs de la case départ, les bras labyrinthe, et la boîte de but sont construites de plexiglas noir pour éliminer les signaux visuels de l'extérieur et l'intérieur du labyrinthe. Maze bras sont de 45 cm de long, 7 cm de haut et 5 cm de large. Les portes menant aux armes consécutifs du labyrinthe sont de 4 cm x 4 cm et sont situés à 11 cm de murs extérieurs du labyrinthe. La boîte de but est de 19,5 cm de long x 7 cm de haut x 5 cm de large. La zone de départ est de 8 cm x 9,5 cm x 7 cm. Séparée claires morceaux de plexiglas sont placés sur le dessus de la zone de départ, labyrinthe, et la boîte de l'objectif de permettre la visualisation de chaque souris à mesure qu'elle progresse dans le dédale, tout en empêchant les souris de s'échapper. Le labyrinthe repose sur une base construite de plexiglas rouge qui est assez grand pour contenir les trois pièces du labyrinthe, plus une cage de pseudo-maison qui est la même taille que la cage de l'animal domestique standard.
- Pour préparer pseudo-home cages avant le procès labyrinthe première litière fraîche de la même nature que celui utilisé dans des cages des animaux à domicile »est ajouté au fonds de cage individuelle ayant des portes (2 cm x 2 cm) coupés sur les côtés. Placez fils sommets sur ces fonds en cage individuellement et de les numéroter, un pour chaque animal dans une cohorte d'essai. Ces cages individuelles servira de pseudo-home cages pour chaque animal pour la durée de la période d'essai. Parce que nous étudions le rôle du stress et / ou de l'anxiété des comportements liés à l'apprentissage et la mémoire, nous utilisons des pseudo-cages à domicile pour éviter les souris individuellement logement dans leurs cages à domicile. Toutefois, si ces facteurs ne sont pas la principale préoccupation, les animaux peuvent être hébergés individuellement dans des cages à domicile modifiés avec des portes et ces cages peuvent servir les cages à domicile pour la navigation labyrinthe succès.
2. Test:
- Chaque jour, les animaux sont déplacés vers la salle d'examen le comportement d'un minimum d'une heure avant le test afin de leur permettre de s'acclimater à l'environnement de test.
- Trente minutes avant l'heure de début des tests, de la nourriture et l'eau est retirée de toutes les cages à domicile. Gardez la nourriture et l'eau dans la salle de test de comportement, mais hors de portée de la souris. Nourriture et l'eau est généralement enlevé 30 min après le changement de la phase de la lumière à la phase d'obscurité, après le repas de pointe s'est produite. Cela garantit que les animaux sont pour la plupart des aliments et d'eau rassasiés avant le test, cependant, les tests pendant cette période donne une petite force supplémentaire de motivation pour naviguer dans le labyrinthe, même si il n'ya pas de nourriture ou de récompense manifeste de l'eau à l'achèvement des tâches.
- Après la période de 30 min avant le test s'est écoulé, nettoyer le labyrinthe avec 70% d'éthanol. Laissez la porte menant de la zone de départ dans le labyrinthe bras fermés. Les portes aux deux extrémités de la boîte de but sont laissés ouverts.
- Placez la cage pseudo-home correspondant au premier animal à l'extrémité de la boîte de but.
- Effectuer la première souris au labyrinthe, il ventouses dans votre main. Placez la souris dans la zone de départ et remettre le couvercle.
- Lorsqu'il est en position d'observer le dédale sans obstruction, ouvrez la porte de la boîte de départ et commencer immédiatement à trois chronomètres.
- Lorsque les quatre pattes de la souris ont quitté la zone de départ, fermer la porte de la boîte démarrer et arrêter le premier temporisateur.
- Enregistrement à la main le chemin de la souris se déplace comme il navigue dans le labyrinthe. Une souris entre dans une nouvelle zone ou le bras du labyrinthe où les quatre pattes ont franchi dans cette zone (voir fig. 1).
- Lorsque les quatre pattes entrer dans la boîte but, fermer la porte menant entre le labyrinthe et la boîte de but et d'arrêter le deuxième chrono.
- Lorsque la souris est complètement entrée dans la cage de pseudo-maison, fermer la porte entre la boîte de but et la cage. Arrêtez le troisième chrono.
- Enregistrement des temps des trois chronomètres. Comptez le nombre d'erreurs de la souris a fait. Une erreur est défini comme une entrée dans une impasse en cul-de-sac de zone (par exemple, allant de L bras pour la zone K;. Fig 1) ou en voyage en arrière à travers un bras déjà parcouru le labyrinthe (par exemple, allant de F bras à bras C, fig 1).. Alors que nous marquons les performances de la souris comme elle se produit, il est possible de filmer ou autrement essais labyrinthe d'enregistrement pour permettre notation subséquente soit par l'œil ou par un logiciel automatisé. Discrétion de l'expérimentateur doit être utilisé pour choisir une méthode appropriée.
- Laissez l'animal dans la cage de pseudo-home pendant 1 min avant de le retourner dans sa cage à la maison.
- Répétez les étapes 2.3 à 2.12 pour toutes les souris dans la cohorte des tests.
- Quand la souris dernière dans la cohorte a été retourné à sa cage, de lancer le chronomètre de 30 minutes. A la fin de cette période de 30 min, retournez la nourriture et l'eau pour toutes les souris dans la cohorte et revenir ensuite les animaux dans leur chambre colonie.
- Répétez cette procédure sur nuits consécutives, avec un essai par jour et par animal tests, jusqu'à ce que toutes les souris de la cohorte ont atteint un des critères d'apprentissage définis ou jusqu'à ce qu'un n prédéterminésOmbre d'essais de test a eu lieu. Une souris est classé comme ayant appris le labyrinthe où il peut accomplir la tâche avec 0 ou 1 erreur (s) sur deux essais consécutifs. Les souris sont testées dans le même ordre sur les essais successifs.
3. Les résultats représentatifs:
Jours d'apprendre (portée critère) peuvent être analysés et comparés entre les différents groupes dans une étude particulière (fig. 2A et 3A). Par ailleurs, un indice de l'apprentissage (apprentissage ratio), qui caractérise l'acquisition labyrinthe, peut être évalué au cours des quatre premiers jours de la période d'essai (figures 2B et 3B). L'indice de l'apprentissage est le rapport entre le nombre de segments de chemin parcouru correcte au nombre total de segments de chemin parcouru pour chaque essai. L'indice de l'apprentissage devrait être en moyenne d'environ 0,5 pour l'essai 1, lorsque les souris sont d'abord exposés à du labyrinthe et de naviguer au hasard. Les augmentations de l'indice d'apprentissage et d'approches entre les essais 1 2 et 4 indiquant que l'apprentissage est en cours. Dans la figure 2, le jeune (2 mois) et au vieillissement (24 mo) les souris mâles C57Bl/6NCr ont été formés sur le labyrinthe de Lashley pour 15 essais. Les jeunes ont appris des souris dans le labyrinthe de 7,2 (± 1,5) d. En revanche, les animaux du vieillissement a pris 11,7 (± 2,1) pour atteindre d critère. Il y avait une forte tendance pour les souris C57Bl/6NCr le vieillissement de prendre plus de temps à apprendre le labyrinthe ([t (23) = 1,59, p = 0,056]; un test t bilatéral, une hypothèse a priori que les jours d'apprendre est plus dans le vieillissement souris). Lorsque l'indice est calculé d'apprentissage, deux groupes d'âge montrent une augmentation régulière de l'indice de l'apprentissage à partir des essais 2 à 4 (effet principal significatif de temps P <0,001). Cependant, il n'y avait aucune différence statistiquement significative de l'indice d'apprentissage entre jeunes et vieux C57 souris souris C57 (principal effet de l'âge P = 0,58).
La figure 3 est représentatif des études examinant les effets de la souche de base sur l'apprentissage des comportements. Les données de l'C57Bl/6NCr jeune mâle Fig. 2 sont maintenant comparés aux données de jeunes Crl: CD-1 (ICR) BR souris [CD-1, 4-5 Mo]. Souris CD-1 a appris le labyrinthe Lashley III 4.5 (± 1.4) d; cependant, il n'y avait aucune différence significative entre les souches dans les jours à apprendre (figure 3A; [t (18) = 1,328, P = 0,20], deux -tailed test t). En revanche, l'examen de la montre l'indice d'apprentissage qui, alors que tous les animaux ont été de naviguer dans le labyrinthe sur le premier essai par hasard, souris CD-1 a appris la tâche plus rapidement (effet principal de la souche P <0,001). Ceci est illustré par l'augmentation statistiquement significative de l'indice de l'apprentissage dans les essais 2 à 4 de la souris CD-1 par rapport à des souris C57Bl/6NCr. Fait intéressant, si souris CD-1 continuent d'être formés dans le labyrinthe au delà du point d'atteindre critère, ils présentent un comportement indicative de surentraînement (fig. 4), qui est examinée plus en détail ci-dessous.
Figure 1:. Le labyrinthe de Lashley III l'impasse en cul-de-sac zones du labyrinthe sont de couleur rouge dans ce diagramme à des fins d'illustration seulement. La base et le bras du labyrinthe sont réelles couleurs solides (en médaillon). Le labyrinthe est dessiné à l'échelle (les dimensions dans le texte).
Figure 2: Performance Lashley labyrinthe III en 2 et 24 mois souris mâles C57Bl/6NCr Le labyrinthe Lashley III a été utilisé pour évaluer l'apprentissage des routes dans les jeunes (2 Mo) et au vieillissement (24 mo) les souris mâles C57Bl/6NCr.. Les paramètres mesurés étaient: (a) jours pour critère, le nombre de jours requis pour une souris à courir dans le labyrinthe pour deux nuits consécutives avec 0 ou 1 erreur d'erreur, et (b) l'indice d'apprentissage, le nombre d'entrées correctes bras quatre pattes faite par rapport au nombre total d'entrées-bras en les jours 1-4 de tests Lashley labyrinthe III. Le nombre d'animaux par groupe ont été n = 10 pour 2 mois et n = 15 pour 24 mois chez la souris.
Figure 3: performances Lashley labyrinthe III en C57Bl/6NCr jeune homme et souris CD-1 Le labyrinthe Lashley III a été utilisé pour évaluer l'apprentissage des routes en 2 mois et 4-5 mois C57Bl/6NCr âgé souris CD-1.. Les paramètres mesurés étaient: (a) jours pour critère, le nombre de jours requis pour une souris à courir dans le labyrinthe pour deux nuits consécutives avec 0 ou 1 erreur d'erreur, et (b) l'indice d'apprentissage, le nombre d'entrées correctes bras quatre pattes faite par rapport au nombre total d'entrées-bras en les jours 1-4 de tests Lashley labyrinthe III. Le nombre d'animaux par groupe ont été n = 10 pour C57Bl/6NCr et n = 10 pour souris CD-1. Significations statistiques: * p <0,05, ** P <0,01 versus souris C57Bl/6NCr.
Figure 4: performances Lashley labyrinthe III en 4-5 mois mâles âgés de souris CD-1 Le labyrinthe Lashley III.a été utilisée pour évaluer l'apprentissage des routes dans dix 4-5 mois mâles âgés de souris CD-1 sur 15 jours consécutifs. Les paramètres mesurés sont (a) le nombre d'erreurs commises par jour, avec une erreur définie comme une entrée de quatre patte dans une zone morte-end en cul-de-sac ou voyagez un bras déjà parcouru le labyrinthe, et (b) temps passé dans le labyrinthe par jour. Le critère de la journée où a été atteint est indiqué par une flèche rouge.
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Discussion
Les tests chez les rongeurs les plus couramment utilisés pour évaluer l'apprentissage de comportement et la mémoire sont la piscine de Morris et des variantes de conditionnement de la peur 2. Ces tests reposent sur des indices visuels ou auditifs pour l'apprentissage et des stimuli aversifs (par exemple, l'eau, choc électrique) pour motiver les animaux pour compléter les 3 tâches. Chez les rongeurs vieillissement, comme chez les humains du vieillissement, des modalités sensorielles diminuer avec le temps. Plusieurs souches de souris de fond perdre leur audience ou de développer des cataractes à mesure qu'ils vieillissent, et les taux de mortalité après 23,5 h de privation d'eau ont été montré pour augmenter chez la souris comme ils l'âge de 4. Ainsi, l'évolution des performances dans ces épreuves plus largement utilisés peuvent être difficiles à interpréter chez les rongeurs vieillissement.
Le labyrinthe de Lashley III a d'abord été décrit par Karl Lashley en 1929 5. Lashley utilisé ce paradigme pour rechercher l'engramme de mémoire dans le cortex en utilisant des techniques lesioning corticale. Nous avons légèrement modifié le labyrinthe d'origine pour permettre son application étendue à des études impliquant des rongeurs vieillissement. Nous avons éliminé alimentaire indicé de navigation du labyrinthe et a démontré que la cage d'un environnement pseudo-home offre une motivation suffisante pour les souris à la fois jeunes et le vieillissement de naviguer dans le labyrinthe 1. D'autres chercheurs ont également utilisé une récompense alimentaire granulés pour faciliter l'apprentissage du labyrinthe Lashley III 7. Visuellement-indicé de navigation, comme celui requis dans le labyrinthe d'eau de Morris et le labyrinthe Barnes circulaire, a été minimisé 2,6,8. Souris ne sont pas privés de nourriture à 90% de leur poids corporel, tel que requis pour plusieurs variantes du labyrinthe à bras radial, Y-labyrinthe et labyrinthe en T tâches 2,9-10. Plutôt, la nourriture et l'eau est disponible pour les animaux ad libitum et est seulement retiré 30 min avant chaque épreuve des tests avec des tests qui ont lieu généralement pendant la phase active sombre. La nourriture est retourné 30 min après la dernière souris dans une cohorte a terminé la tâche et est dissociée temporellement du retour à la cage pseudo-home afin de ne pas agir comme une récompense manifeste pour achever la tâche. Fait important, manque de nourriture et d'eau pour la cohorte entière ne doit pas s'étendre au-delà d'une période de 4-5 h par procès. En outre, les souris représentant différents groupes expérimentaux doivent être testés ensemble sur les mêmes nuits.
La modularité du labyrinthe Lashley III permet d'apporter des modifications destinées à tester les différents aspects de l'apprentissage de rétention. Par exemple, tandis que l'acquisition se produit avec le labyrinthe dans une configuration spécifique, une fois l'acquisition est établie, le labyrinthe peut être pivoté de sorte que les souris doivent se tourner dans la direction opposée pour compléter la tâche, c'est à dire, les souris vont tourner à droite sortant de la zone de départ pour réussir à naviguer dans le labyrinthe lors de l'acquisition, mais la flexibilité de l'apprentissage (rappel) peut être mesuré par la rotation du labyrinthe afin que les souris doivent tourner à gauche hors de la zone de départ pour la navigation réussie. D'autres variantes de la procédure de test comprennent l'établissement d'apprentissage pour une période de temps (habituellement 14 d) et permettant ensuite un intervalle de retard de plusieurs semaines, après quoi la rétention de l'apprentissage labyrinthe est mesurée. Intervalles de rétention doivent être établis par un travail pilote et sont study-/strain-dependent. Sessions de formation plus longues tendent à être associées avec des intervalles de rétention plus longue. Modifications de la procédure de Lashley labyrinthe III se comprennent l'ajout de marques olfactives ou des stimuli sonores de fournir une motivation supplémentaire pour la navigation labyrinthe succès. Les facteurs de stress tels que le stress de retenue peut être appliquée à différents moments avant, pendant ou après l'acquisition d'enquêter dépendant de l'état d'apprentissage et de mémoire.
Un facteur important à considérer lors de la mise en œuvre du labyrinthe Lashley III est la durée de l'intervalle de formation. La plupart des souches de souris consanguines disponibles et consanguine, y compris C57BL / 6, Swiss Webster et BXD souris consanguines recombinantes, atteindra le critère d'apprentissage dans les 14 jours. Certaines souches, surtout souris CD-1, après avoir atteint critère de seulement 7 jours. Le surentraînement de certaines souches de souris provoque un comportement aberrant dans le labyrinthe, les souris par laquelle elle peut commencer à montrer une augmentation constante et rapide du nombre d'erreurs commises par essai et le temps passé à explorer le labyrinthe. La figure 4 est représentatif d'un surentraînement en 4-5 mois mâles âgés de souris CD-1. Après la première exposition du labyrinthe, nous instituer un 15 minutes de coupure par période d'essai pour chaque souris. Après 15 min, la souris est amené à travers le labyrinthe de la cage de pseudo-maison et erreurs ne sont pas comptés une fois la barre des 15 minutes a été atteinte. Si plusieurs souris dans une cohorte ou une étude plus large besoin d'être conduit à travers le labyrinthe après avoir atteint les critères d'apprentissage, cela peut être le signe de surentraînement. Afin de contourner des problèmes avec le surentraînement et de raccourcir la durée du test global, nous avons limité la phase d'acquisition de quatre essais dans certaines études une moyenne de l'indice de l'apprentissage de la troisième et quatrième essais afin de déterminer un score d'apprentissage. Ce score d'apprentissage peut être comparé à la place dejours pour apprendre.
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Disclosures
Tous les protocoles de comportement ont été approuvées par les soins de la Pennsylvania State University et le Comité institutionnel d'animaux utilisation. Il n'y a pas divulgation de renseignements financiers à signaler.
Acknowledgments
Le labyrinthe de Lashley III utilisé pour ces expériences a été construit par Tim Bowmaster, Paul Corman, Barry Dutrow, Ryan Jabco, et Tim Treaster partir de la boutique la Pennsylvania State University Physics Department machine. Les auteurs tiennent à remercier Mme Shoba Belegundu, Mme Tara Chrzanowski, et Mme Alexandra Lewis pour l'assistance dans l'exécution des expériences présentées dans les figures 2-4. M. Walter Jackson a fourni une rétroaction précieuse dans la préparation de ce protocole. Ce travail a été soutenu financièrement par le National Institute of Mental Health (MH064756 et MH077978 à AMA). Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national de santé mentale ou de la National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lashley III maze | PSU Physics Machine Shop | N/A | Maze must be custom-built, not commercially available |
References
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