Summary
O labirinto Lashley III é uma tarefa rota-aprendizagem que não depende de estímulos aversivos ou estímulos visuais. É, portanto, uma opção altamente atraente para avaliar a aprendizagem ea memória, especialmente em ratos do envelhecimento ou de outra forma, onde o stress é uma consideração.
Abstract
Muitos testes de comportamento desenhado para avaliar o aprendizado ea memória em roedores, especialmente ratos, dependem de pistas visuais, privação de alimento e / ou água, ou outros estímulos aversivos para motivar a aquisição de tarefas. Como idade dos animais, modalidades sensoriais deteriorar-se. Por exemplo, muitas cepas de camundongos desenvolvem déficit auditivo ou catarata. Alterações nos sistemas sensoriais necessárias para orientar os ratos durante a aquisição tarefa presente confunde potencial em interpretar as mudanças de aprendizagem em animais de envelhecimento. Além disso, o uso de estímulos aversivos para motivar os animais para aprender tarefas é potencialmente de confusão quando se comparam os ratos com sensibilidade diferencial ao estresse. Para minimizar esses tipos de efeitos de confusão, temos implementado uma versão modificada do labirinto Lashley III. Este labirinto se baseia na aprendizagem rota, pela qual os ratos aprendem a navegar em um labirinto através de exposição repetida sob condições de estresse baixo, fase escura, por exemplo, não privação de alimento / água, até que percorrer um caminho a partir do local de início para uma gaiola pseudo-casa com 0 ou 1 erro (s) em dois ensaios consecutivos. Podemos classificar isso como um teste de comportamento de baixa tensão, porque não depende de estímulos aversivos para incentivar a exploração do labirinto e aprendizagem da tarefa. O aparelho consiste de uma caixa de começar a modular, um corpo labirinto de 4 braços, e uma caixa de meta. No final da caixa de meta é uma gaiola de pseudo-casa que contém cama semelhante ao encontrado na jaula do animal em casa e é específico para cada animal para a duração do ensaio labirinto. Foi demonstrado anteriormente que este pseudo-gaiola casa oferece recompensa suficiente para motivar os ratos para aprender a navegar pelo labirinto
Protocol
1. Preparação:
- O labirinto Lashley III é construído de Plexiglas e é mostrado na Figura 1. A caixa de começar, braços labirinto, e caixa de meta são modulares para permitir a limpeza e modificabilidade do labirinto. As paredes da caixa de começar, braços labirinto, e caixa de meta são construídas de Plexiglas para eliminar pistas visuais de fora e dentro do labirinto. Braços labirinto são 45 cm de comprimento, 7 cm de altura e 5 cm de largura. Portas que dão para os braços consecutivos do labirinto são 4 cm x 4 cm e estão situado a 11 cm das paredes exteriores do labirinto. A caixa de meta é de 19,5 cm de comprimento x 7 cm de altura x 5 cm de largura. A caixa de começar é 8 cm x 9,5 cm x 7 cm. Separar peças transparentes de acrílico são colocados em cima da caixa de começar, labirinto, e caixa de meta para permitir a visualização de cada rato à medida que progride através do labirinto, evitando a fuga dos ratos. O labirinto repousa sobre uma base construída de acrílico vermelho que é grande o suficiente para manter as três peças do labirinto uma gaiola pseudo-casa que é do mesmo tamanho da gaiola do animal para casa padrão.
- Para preparar pseudo-home gaiolas antes do julgamento labirinto em primeiro lugar, material de cama nova do mesmo tipo que o utilizado em gaiolas dos animais em casa é adicionado ao fundo da gaiola individuais com portas (2 cm x 2 cm) corte nas laterais. Fios lugar tops nesses fundos gaiola e numerá-las individualmente, uma para cada animal em uma coorte de testes. Essas gaiolas individuais servirá como pseudo-home gaiolas para cada animal para a duração do período de testes. Porque estamos investigando os papéis de estresse e / ou ansiedade relacionados com comportamentos na aprendizagem e memória, usamos pseudo-home gaiolas para evitar individualmente em gaiolas de camundongos habitação de sua casa. No entanto, se esses fatores não são uma preocupação primordial, os animais podem ser alojados individualmente em gaiolas casa modificado com portas e estas gaiolas podem servir como as gaiolas casa para navegação labirinto de sucesso.
2. Testes:
- Cada dia, os animais são movidos para a sala de testes de comportamento, no mínimo, uma hora antes do teste, que lhes permitam adaptar ao ambiente de teste.
- Trinta minutos antes do início comida o tempo de teste, ea água é removida de todas as gaiolas casa. Manter os alimentos e água na sala de testes de comportamento, mas fora do alcance dos ratos. Comida e água normalmente é removido 30 min após a mudança da fase de luz para a fase de escuro, após a alimentação pico ocorreu. Isso garante que os animais são principalmente alimentos e água saciada antes do teste, no entanto, testes durante este período fornece uma pequena força adicional de motivação para navegar pelo labirinto, embora não há comida aberta ou recompensa de água após a conclusão da tarefa.
- Após o período de pré-teste 30 min tenha decorrido, limpe o labirinto com etanol 70%. Deixe a porta principal da caixa começar no labirinto braços fechados. As portas em ambas as extremidades da caixa de meta são deixadas em aberto.
- Coloque a gaiola pseudo-casa correspondente ao primeiro animal no final da caixa de meta.
- Realizar o primeiro rato para o labirinto, colocando-o na mão. Coloque o mouse na caixa de início e recoloque a tampa.
- Quando em posição de observar o labirinto sem obstrução, abra a porta caixa de início e começar imediatamente a três cronômetros.
- Quando todas as quatro patas do rato deixaram a caixa de começar, feche a porta caixa de começar e parar o temporizador em primeiro lugar.
- Registro pela mão do caminho o mouse viaja como ele navega pelo labirinto. Um rato entra em uma nova zona ou no braço do labirinto, quando todas as quatro patas atravessaram a fronteira para essa área (ver Fig. 1.).
- Quando todas as quatro patas entrar na caixa de gol, fechar a porta que conduz entre o labirinto ea caixa de gol e parar o cronômetro segundo.
- Quando o mouse foi completamente entrou na gaiola de pseudo-casa, feche a porta entre a caixa de gol e da gaiola. Parar o cronômetro terceiros.
- Registo dos tempos dos três cronômetros. Contar o número de erros, o mouse tem feito. Um erro é definido como uma entrada em um beco sem saída cul-de-sac zona (por exemplo, passando de L braço para zona de K;. Fig 1) ou viajar de volta através de um braço já viajou do labirinto (por exemplo, indo de F braço a braço C; Fig. 1).. Enquanto nós pontuação de desempenho do mouse, uma vez que está ocorrendo, é possível filmar ou ensaios labirinto registro para permitir a pontuação subseqüente ou por olho ou por software automatizado. Experimentador critério deve ser usado para escolher um método apropriado.
- Deixar o animal na gaiola pseudo-casa por 1 min antes de voltar para sua gaiola em casa.
- Repita os passos 2,3-2,12 para todos os ratos no grupo de testes.
- Quando o mouse na última coorte foi devolvido à sua gaiola, iniciar o temporizador de 30 min. No final deste período de 30 min, o retorno de alimentos e água para todos os ratos no grupo e em seguida, retornar os animais à sua sala de colônia.
- Repita este procedimento em noites consecutivas, com um ensaio por dia de testes por animal, até que todos os ratos no grupo chegaram a um critério de aprendizagem definidos, ou até um determinado number de ensaios de teste ocorreu. Um rato é classificada como tendo aprendido no labirinto quando ele pode realizar a tarefa com 0 ou 1 erro (s) em dois ensaios consecutivos. Ratos são testados na mesma ordem em ensaios sucessivos.
3. Resultados representativos:
Dias para aprender (alcance critério) podem ser analisadas e comparadas entre os diferentes grupos em um estudo particular (Figs. 2A e 3A). Além disso, um índice de aprendizagem (learning ratio), que caracteriza a aquisição labirinto, pode ser avaliado ao longo dos primeiros quatro dias do período de testes (Figs. 2B e 3B). O índice de aprendizagem é a relação entre o número de segmentos caminho correto viajou para o número total de segmentos de caminho percorrido para cada julgamento. O índice de aprendizagem média deve ser de aproximadamente 0,5 para julgamento 1, quando os camundongos são expostos pela primeira vez para o labirinto e navegando por acaso. O aumento do índice de aprendizagem e se aproxima de 1 entre os ensaios 2 e 4, indicando que a aprendizagem está ocorrendo. Na Figura 2 jovens (2 meses) e envelhecimento (24 meses) ratos C57Bl/6NCr masculino foram treinados no labirinto Lashley para até 15 testes. Os ratos jovens aprenderam o labirinto em 7,2 (± 1,5) d. Em contraste, os animais de envelhecimento levou 11,7 (± 2,1) d para chegar critério. Houve uma forte tendência para os ratos C57Bl/6NCr envelhecimento para ter mais tempo para aprender o labirinto ([t (23) = 1,59, P = 0,056]; one-tailed t-teste, uma hipótese a priori que os dias a aprender é mais no envelhecimento camundongos). Quando o índice de aprendizagem é calculada, ambos os grupos etários mostram um aumento contínuo no índice de aprendizagem dos ensaios de 2 a 4 (efeito principal significativo de tempo P <0,001). No entanto, não houve diferença estatisticamente significativa no índice de aprendizagem entre jovens e velhos camundongos C57 C57 ratos (efeito principal de idade P = 0,58).
Figura 3 é representativa de estudos examinando os efeitos da tensão de fundo na aprendizagem de comportamento. Dados do jovem macho C57Bl/6NCr mostrado na figura. 2 estão agora em comparação com dados de Crl jovens: CD-1 (ICR) BR camundongos [CD-1, 4-5 mo]. CD-1 camundongos aprenderam o labirinto Lashley III em 4,5 (± 1,4) d, no entanto, não houve diferença significativa entre as cepas em dias de aprender (Fig. 3A; [t (18) = 1,328, P = 0,20]; dois -tailed t-teste). Por exame de contraste, do índice de aprendizagem mostra que, embora todos os animais foram navegar pelo labirinto no primeiro julgamento por acaso, um CD-ratos aprenderam a tarefa mais rapidamente (efeito principal da pressão P <0,001). Isto é ilustrado pelo aumento estatisticamente significativo no índice de aprendizado em testes de 2 a 4 em camundongos CD-1 em comparação com camundongos C57Bl/6NCr. Curiosamente, se camundongos CD-1 continuam a ser treinados no labirinto além do ponto de chegar a critério, eles exibem um comportamento indicativo de overtraining (Fig. 4) que é discutido em maiores detalhes abaixo.
Figura 1:. O labirinto Lashley III Os mortos-end cul-de-sac zonas do labirinto são de cor vermelha no diagrama apenas para fins ilustrativos. A base e os braços do labirinto, são de cores sólidas (inset). O labirinto é desenhado em escala (dimensões em texto).
Figura 2: Lashley desempenho maze III em 2 e 24 meses de idade, os ratos do sexo masculino C57Bl/6NCr O labirinto Lashley III foi usado para avaliar rota de aprendizagem em jovens (2 meses) e envelhecimento (24 meses) ratos C57Bl/6NCr masculino.. Os parâmetros medidos foram: (a) dias para critério, o número de dias necessários para um mouse para executar o labirinto para duas noites consecutivas com 0 erros ou um erro, e (b) o índice de aprendizagem, o número de corrigir entradas quatro pata-braço feito em relação ao número total de entradas nos braços feitos nos dias 1-4 de Lashley teste labirinto III. Número de animais por grupo foram n = 10 para dois meses de idade e n = 15 para 24 meses de idade camundongos.
Figura 3: Lashley desempenho maze III em C57Bl/6NCr jovem macho e camundongos CD-1 O labirinto Lashley III foi usado para avaliar rota de aprendizagem em dois C57Bl/6NCr meses e 4-5 meses de idade, CD-1 camundongos.. Os parâmetros medidos foram: (a) dias para critério, o número de dias necessários para um mouse para executar o labirinto para duas noites consecutivas com 0 erros ou um erro, e (b) o índice de aprendizagem, o número de corrigir entradas quatro pata-braço feito em relação ao número total de entradas nos braços feitos nos dias 1-4 de Lashley teste labirinto III. Número de animais por grupo foram n = 10 para C57Bl/6NCr e n = 10 para um CD-ratos. Significâncias estatísticas: * P <0,05, ** P <0,01 contra ratos C57Bl/6NCr.
Figura 4: Lashley desempenho maze III em 4-5 meses de idade camundongos CD-1 O labirinto Lashley III.foi usado para avaliar a aprendizagem em dez rota 4-5 meses de idade do sexo masculino CD-1 camundongos em 15 dias consecutivos. Os parâmetros medidos foram: (a) número de erros cometidos por dia, com um erro definido como uma entrada de quatro patas, em um beco sem saída cul-de-sac zona ou viajar um braço já viajou do labirinto, e (b) tempo gasto no labirinto por dia. O dia em que critério foi alcançado é indicado com uma seta vermelha.
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Discussion
Os testes em roedores mais comumente utilizado comportamental para avaliar a aprendizagem e memória são o labirinto aquático de Morris e variantes de condicionamento do medo 2. Esses testes contam com pistas visuais ou auditivas para a aprendizagem e estímulos aversivos (por exemplo, água, footshock) para motivar os animais para completar as 3 tarefas. Em roedores envelhecimento, como o envelhecimento em seres humanos, modalidades sensoriais declínio ao longo do tempo. Linhagens de camundongos fundo várias perder a audição ou desenvolver cataratas com a idade, e as taxas de mortalidade após 23,5 h de privação de água têm sido mostrados para aumentar em ratos com a idade 4. Assim, as mudanças no desempenho nesses testes mais utilizados podem ser difíceis de interpretar em roedores envelhecimento.
O labirinto Lashley III foi primeiramente descrita por Karl Lashley em 1929 5. Lashley utilizado este paradigma para procurar o engrama de memória no córtex usando técnicas a lesão cortical. Temos ligeiramente modificada do labirinto original para permitir a sua ampla aplicabilidade para estudos envolvendo roedores envelhecimento. Nós eliminamos alimentos cued navegação do labirinto e demonstraram que um ambiente de gaiola pseudo-home fornece motivação suficiente para ratos jovens e de envelhecimento para navegar pelo labirinto 1. Outros pesquisadores também utilizou um alimento recompensa pellet para facilitar a aprendizagem do labirinto Lashley III 7. Visualmente cued navegação, como o que é exigido no labirinto aquático de Morris e da Barnes labirinto circular, tem sido minimizada 2,6,8. Ratos não são privados de alimentos a 90% do seu peso corporal, como é necessário para diversas variações do labirinto radial do braço, Y e T-maze maze-tarefas 2,9-10. Ao contrário, água e alimento é disponível para os animais ad libitum e só é removido 30 min antes de cada julgamento testes com os testes normalmente ocorrendo durante a fase ativa escuro. Alimentos é devolvido 30 min após a última do mouse em uma coorte completou a tarefa e está dissociada temporalmente a partir do retorno à gaiola pseudo-home para não agir como uma recompensa aberta para completar a tarefa. Importante, indisponibilidade de comida e água para toda a coorte não devem ultrapassar um período de 4-5 h por julgamento. Além disso, os ratos representam diferentes grupos experimentais devem ser testados em conjunto sobre as mesmas noites.
A modularidade do labirinto Lashley III permite modificações projetadas para testar os diferentes aspectos da aprendizagem de retenção. Por exemplo, enquanto a aquisição ocorre com o labirinto em uma configuração específica, uma vez que a aquisição é estabelecida, o labirinto pode ser girada de forma que os ratos deve girar na direção oposta para completar a tarefa, ou seja, os ratos vai virar à direita saindo da caixa de começar para navegar com sucesso o labirinto durante a aquisição, mas a flexibilidade de aprendizagem (recall) pode ser medido pela rotação do labirinto para que os ratos deve virar à esquerda para fora da caixa de início de navegação bem sucedida. Variações adicionais do procedimento de teste incluem o estabelecimento de aprendizagem para um determinado período de tempo (geralmente 14 d) e, em seguida, permitindo um intervalo de atraso de várias semanas após o qual a retenção do aprendizado labirinto é medido. Intervalos de retenção devem ser estabelecidos pelo trabalho de piloto e são study-/strain-dependent. Sessões mais longas de treinamento tendem a ser associados com intervalos mais longos de retenção. Modificações da cirurgia do labirinto Lashley III se incluem a adição de pistas ou estímulos odor ruído para fornecer uma motivação adicional para a navegação labirinto de sucesso. Estressores, como o stress de retenção pode ser aplicado em diferentes momentos antes, durante ou após a aquisição para investigar dependente do estado de aprendizagem e memória.
Um fator importante a considerar na implementação do labirinto Lashley III é a duração do intervalo de treinamento. A maioria das cepas de camundongos disponíveis puras e outbred, incluindo camundongos C57BL / 6, Webster suíço, e BxD recombinante camundongos isogênicos, vai chegar o critério de aprendizagem dentro de 14 dias. Algumas cepas, especialmente ratos CD-1, chegar a critério depois de apenas 7 dias. Overtraining de algumas linhagens de camundongos produz comportamento aberrante no labirinto, os ratos em que começará a mostrar um aumento constante e rápido do número de erros cometidos por tentativa e tempo gasto explorando o labirinto. Figura 4 é representativa de overtraining em 4-5 meses de idade do sexo masculino CD-1 camundongos. Após a primeira exposição ao labirinto, que instituir um período de 15 min de corte por tentativa para cada rato. Após 15 min, o mouse é liderada pelo labirinto para a gaiola pseudo-casa e os erros não são contados uma vez a marca de 15 min foi alcançada. Se vários ratos em uma coorte ou em um estudo maior necessidade de ser conduzido através do labirinto depois de atingir os critérios de aprendizagem, este pode ser um indicativo de overtraining. Para contornar problemas com overtraining e para encurtar a duração do teste geral, nós limitamos a fase de aquisição de quatro ensaios em alguns estudos e média do índice de aprendizagem a partir do terceiro e quarto ensaios para determinar a pontuação de aprendizagem. Esta pontuação de aprendizagem pode ser comparado, em lugar dedias para aprender.
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Disclosures
Todos os protocolos foram aprovados pelo comportamento da Universidade Estadual da Pensilvânia Animal Care Institucional e Comitê de uso. Não há divulgações financeiras para relatar.
Acknowledgments
O labirinto Lashley III utilizados para estes experimentos foi construído por Tim Bowmaster, Corman Paulo, Dutrow Barry, Jabco Ryan, Tim e Treaster da Universidade Estadual da Pensilvânia Física Oficina Departamento. Os autores gostariam de agradecer a Sra. Shoba Belegundu, Ms. Tara Chrzanowski, ea Sra. Alexandra Lewis para a assistência na realização dos experimentos apresentados nas Figuras 2-4. Sr. Walter Jackson desde feedback valioso na preparação deste protocolo. Este trabalho foi financiado por recursos do Instituto Nacional de Saúde Mental (MH064756 e MH077978 para AMA). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional de Saúde Mental ou o National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lashley III maze | PSU Physics Machine Shop | N/A | Maze must be custom-built, not commercially available |
References
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