Summary
Den Lashley III labyrinten är en rutt-lärande uppgift som inte är beroende av aversiva stimuli eller visuella referenser. Det är alltså ett mycket attraktivt alternativ för utvärdering av inlärning och minne, särskilt i äldre möss eller på annat sätt, där stress är ett övervägande.
Abstract
Många beteenden tester för att utvärdera inlärning och minne hos gnagare, särskilt möss, förlitar sig på visuella ledtrådar, mat och / eller vattenbrist eller andra aversiva stimuli för att motivera uppgift förvärvet. Som djur ålder, sensoriska modaliteter försämras. Till exempel utveckla många stammar av möss höra underskott eller grå starr. Förändringar i sensoriska system som krävs för att vägleda möss under uppgift förvärvet utgör potentiella förvirrar i att tolka lärandet förändringar i åldrande djur. Dessutom är användningen av aversiva stimuli att motivera djur att lära sig arbetsuppgifter potentiellt störande när man jämför möss med differential känslighet för stress. För att minimera dessa typer av confounding effekter, har vi genomfört en modifierad version av Lashley III labyrint. Denna labyrint är beroende av vägen lärande, där möss lära sig att navigera i en labyrint genom upprepad exponering under låg stress förhållanden, t.ex. mörker fas, ingen mat / vatten umbäranden, tills de navigerar en väg från start plats till en pseudo-buren med 0 eller 1 error (s) på två på varandra följande försök. Vi klassificera detta som en låg-stress beteenden testa eftersom det inte förlitar sig på aversiva stimuli för att uppmuntra utforskning av labyrinten och inlärning av uppgiften. Apparaten består av en modulär start låda, en 4-arm labyrint kropp, och ett mål låda. I slutet av målet box är en pseudo-buren som innehåller sängar liknar den som finns i djurets buren och är specifik för varje djur under hela labyrinten testning. Det har visats tidigare att detta pseudo-buren ger tillräcklig belöning för att motivera möss att lära sig att navigera i labyrinten
Protocol
1. Förberedelser:
- Den Lashley III labyrinten är uppbyggd av plexiglas och visas i figur 1. Starten rutan, armar labyrint, och mål box är modulära för att möjliggöra rengöring och modifiera av labyrinten. Väggarna i början rutan, armar labyrint, och mål låda är tillverkade av svart plexiglas för att eliminera visuella referenser från utsidan och inne i labyrinten. Maze armar är 45 cm lång, 7 cm hög och 5 cm bred. Dörrar som leder till varandra armar av labyrinten är 4 cm x 4 cm och ligger 11 cm från ytterväggar av labyrinten. Målet rutan är 19,5 cm lång x 7 cm hög x 5 cm bred. Starten rutan är 8 cm x 9,5 cm x 7 cm. Separat klart plexiglas bitar ovanpå början rutan labyrint, och mål ruta för att möjliggöra visualisering av varje mus som det fortskrider genom labyrinten samtidigt förhindra möss från att fly. Labyrinten vilar på en bas tillverkad av rött plexiglas som är stor nog att rymma tre stycken av labyrinten plus en pseudo-buren som är i samma storlek som djurets vanliga buren.
- För att förbereda pseudo-hem burar före den första labyrinten rättegången, färskt strö av samma slag som användes i djurens hem burar läggs till enskilda bur bottnar ha dörröppningar (2 cm x 2 cm) skärs i sidorna. Placera wire toppar på dessa bur bottnar och individuellt nummer dem, en för varje djur i en test kohort. Dessa burar kommer att fungera som enskilda pseudo-hem burar för varje djur under hela testet tidsramen. Eftersom vi undersöker roller stress och / eller ångest-relaterade beteenden i inlärning och minne, vi använder pseudo-hem burar för att undvika individuellt bostäder möss i deras hem burar. Men om dessa faktorer inte är av primärt intresse, kan djuren ensamma förvaras i hemmet burar modifierats med dörröppningar och dessa burar kan fungera som hem burar för en lyckad labyrint navigering.
2. Test:
- Varje dag är djur som transporteras till beteendet testa rum minst en timme före testning så att de kan anpassa sig till testmiljön.
- Trettio minuter innan testning starttid, mat och vatten tas bort från alla hem burar. Håll mat och vatten i beteendet testning rummet men utom räckhåll för möss. Mat och vatten är normalt bort 30 minuter efter bytet från ljuset fasen till den mörka fasen, efter topp utfodring har inträffat. Detta säkerställer att djuren är mestadels mat-och vatten-mätta före testning, men testning under denna period ger en liten extra motiverande kraft för att navigera i labyrinten även om det inte finns någon uppenbar mat eller vatten belöning när uppgiften har slutförts.
- Efter 30 min provkörning har löpt ut, rena labyrinten med 70% etanol. Lämna dörren från början lådan in i labyrinten armarna stängd. Dörrarna i båda ändar av målet rutan är öppen.
- Placera pseudo-buren som motsvarar den första djuret i slutet av målet rutan.
- Bär den första musen till labyrinten, koppning den i handen. Placera musen i start rutan och tillbaka locket.
- När du är i stånd att observera labyrinten utan hinder, öppna dörren börjar lådan och omedelbart börja tre stoppur.
- När alla fyra tassar på musen har lämnat start rutan, stäng dörren start boxen och stoppa den första timern.
- Rekord för hand vägen musen resor som navigerar en labyrint. En mus går in i en ny zon eller armen ur labyrinten när alla fyra tassar har passerat in i detta område (se figur. 1).
- När alla fyra tassar in i mål rutan, stäng dörren mellan labyrinten och målet rutan och stoppa den andra stoppuret.
- När musen helt har kommit in i pseudo-buren, stäng dörren mellan målet rutan och buren. Stoppa den tredje stoppuret.
- Spela in tider från de tre stoppur. Räkna antalet fel musen har gjort. Ett fel definieras som ett inträde i en återvändsgränd cul-de-sac zon (t.ex. gå från armen L till zon K.. Fig 1) eller reser tillbaka genom en redan rest arm labyrinten (t.ex. gå från arm F till arm C, Fig. 1).. Medan vi poäng musen prestanda som det sker, är det möjligt att spela in på video eller på annat sätt spela försök labyrint för att möjliggöra efterföljande poängsättning antingen genom öga eller genom automatiserad programvara. Försöksledaren diskretion bör användas för att välja en lämplig metod.
- Låt djuret i pseudo-buren i 1 minut innan han återvände till sitt hem bur.
- Upprepa steg från 2,3 till 2,12 för alla möss i testerna kohorten.
- När den sista musen i kohorten har återgått till sitt hem bur, startar 30 min timer. I slutet av denna 30 min period, återvända mat och vatten till alla möss i kohorten och sedan tillbaka djuren till sin koloni rum.
- Upprepa denna procedur på nätter i följd, med ett försök per test dag per djur, tills alla möss i kohorten har nått en definierad lära kriterier eller tills ett förutbestämt numbra av test prövningar har inträffat. En mus klassificeras som att ha lärt sig en labyrint när det kan utföra uppgiften med 0 eller 1 error (s) på två på varandra följande försök. Möss testas i samma ordning på varandra följande försök.
3. Representativa resultat:
Dagar för att lära sig (nå kriteriet) kan analyseras och jämföras mellan olika grupper i en särskild studie (bild 2A och 3A). Dessutom kan en lärande index (inlärning ratio), vilket präglar labyrint förvärvet att utvärderas under de första fyra dagarna av testperioden (bild 2B och 3B). Den lärande index är förhållandet mellan antalet korrekta bansegment reste till det totala antalet bansegment rest för varje prövning. Den genomsnittliga lärandet indexet bör vara ca 0,5 för rättegång 1, när mössen först är utsatta för labyrinten och navigering av en slump. Det lärande index stiger och närmar 1 mellan försök 2 och 4 visar att lärande sker. I Figur 2, unga (2 mån) och åldrande (24 mån) manliga C57Bl/6NCr möss tränades på Lashley labyrint i upp till 15 försök. De unga möss lärt sig labyrinten i 7,2 (± 1,5) d. Däremot tog den åldrande djur 11,7 (± 2,1) d att nå kriterium. Det fanns en stark trend för åldrande C57Bl/6NCr möss att ta längre tid att lära sig labyrinten ([t (23) = 1,59, p = 0,056], ensidigt t-test, a priori hypotes som dagar för att lära sig är längre hos äldre möss). När lärandet Indexet beräknas, båda åldersgrupperna visar en stadig ökning av lärandet index från försök 2 till 4 (signifikant huvudeffekt av tid P <0,001). Det fanns dock inga statistiskt signifikanta skillnader i inlärningsprocessen index mellan unga C57 möss och gamla C57 möss (huvudsakliga effekten av ålder P = 0,58).
Figur 3 är representativ för studier undersöker effekterna av bakgrunden påfrestningar på lärande beteende. Data från de unga manliga C57Bl/6NCr visas i bild. 2 är nu jämfört med data från unga CRL: CD-1 (ICR) BR möss [CD-1, 4-5 mo]. CD-1 mus lärt Lashley III labyrint i 4,5 (± 1,4) d, men det fanns ingen signifikant skillnad mellan stammar i dagar för att lära sig (Fig. 3A, [t (18) = 1,328, P = 0,20], två -tailed t-test). Däremot undersökning av lärandet index visar att även om alla djur navigerar en labyrint på den första rättegången av en slump lärde CD-1 mus uppgiften snabbare (huvudsakliga effekten av stam P <0,001). Detta illustreras av den statistiskt signifikant ökning av lärandet index i försök 2 till 4 i CD-1 mus jämfört med C57Bl/6NCr möss. Intressant om CD-1 mus fortsätta att utbildas i labyrinten bortom nå kriterium uppvisar de beteenden som tyder på överträning (bild 4) som diskuteras närmare nedan.
Figur 1:. Den Lashley III labyrinten Den återvändsgränd cul-de-Sac zoner av labyrinten är rödfärgade i detta diagram är illustrativ. Basen och armar av den faktiska labyrinten är solida färger (infälld). Labyrinten är skalenlig (mått i texten).
Figur 2: Lashley III labyrint prestanda i 2 och 24 månader gamla manliga C57Bl/6NCr möss Lashley III labyrinten användes för att bedöma väg lärande i unga (2 mån) och åldrande (24 mån) manliga C57Bl/6NCr möss.. Det som mättes var (en) dagar kriterium, det antal dagar som krävs för en mus att köra labyrinten för två nätter i rad med 0 fel eller ett fel, och (b) lärande index antalet korrekta fyra-tass arm poster gjorde kontra det totala antalet armen noteringar som görs på dagar 1-4 av Lashley III labyrint testning. Antalet djur per grupp var n = 10 för 2 månader gamla och n = 15 för 24 månader gamla möss.
Figur 3: Lashley III labyrint prestanda i unga manliga C57Bl/6NCr och CD-1 mus Den Lashley III labyrinten användes för att bedöma väg lärande i 2 månader gamla C57Bl/6NCr och 4-5 månader gamla CD-1 mus.. Det som mättes var (en) dagar kriterium, det antal dagar som krävs för en mus att köra labyrinten för två nätter i rad med 0 fel eller ett fel, och (b) lärande index antalet korrekta fyra-tass arm poster gjorde kontra det totala antalet armen noteringar som görs på dagar 1-4 av Lashley III labyrint testning. Antalet djur per grupp var n = 10 för C57Bl/6NCr och n = 10 för CD-1 möss. Statistisk betydelser: * p <0,05, ** p <0,01 jämfört C57Bl/6NCr möss.
Figur 4: Lashley III labyrint prestanda i 4-5 månader gammal hane CD-1 mus Den Lashley III labyrint.användes för att bedöma väg lärande i tio 4-5 månader gammal hane CD-1 mus på 15 dagar i följd. Det som mättes var (a) antalet fel som görs varje dag, med ett fel definieras som en fyra-tass inträde i en återvändsgränd cul-de-sac zon eller reser en redan rest arm labyrinten, och (b) tiden i labyrinten per dag. Den dag då kriteriet nåddes indikeras med en röd pil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vanligaste gnagare beteendemässiga undersökningar för att utvärdera inlärning och minne är Morris water maze och varianter av rädsla konditionering 2. Dessa tester är beroende av visuella eller auditiva ledtrådar för inlärning och aversiva stimuli (t ex vatten, footshock) att motivera djur för att slutföra uppgifter 3. I äldre gnagare, för åldrande människor, sensoriska modaliteter minska. Flera bakgrund musstammar förlorar sin hörsel eller utveckla grå starr när de blir äldre, och dödligheten efter 23,5 h vatten umbäranden har visat sig öka på möss när de blir äldre 4. Således kan förändringar i prestanda i dessa mer utbredda tester vara svåra att tolka i åldrande gnagare.
Den Lashley III labyrinten beskrevs första gången av Karl Lashley 1929 5. Lashley använde detta paradigm för att söka efter minnet engram i cortex med hjälp av kortikala lesioning tekniker. Vi har lite ändrade den ursprungliga labyrinten för att möjliggöra sitt breda tillämplighet på studier med åldrandet gnagare. Vi har eliminerat livsmedel cued navigering av labyrinten och visade att en pseudo-buren miljö ger tillräcklig motivation för att både unga och äldre möss för att navigera i labyrinten 1. Andra forskare har också använt en mat pellets belöning för att underlätta inlärning av Lashley III labyrint 7. Visuellt-cued navigering, precis som krävs i Morris water maze och Barnes cirkulära labyrint, har minimerats 2,6,8. Möss är inte mat berövas till 90% av sin kroppsvikt, som krävs för flera varianter av den radiella armen labyrinten, Y-labyrint och T-labyrint uppgifter 2,9-10. Snarare är mat och vatten tillgängligt för djuren ad lib och är endast bort 30 min före varje test studie med tester vanligtvis äger rum under den aktiva mörk fas. Mat är tillbaka 30 minuter efter den sista musen i en kohort har slutfört uppdraget och är dissocierade tidsmässigt från återgå till pseudo-buren så att inte agera som en uppenbar belöning för att slutföra uppgiften. Viktigt bör avsaknad av mat och vatten för hela kohorten inte vara längre än en period av 4-5 timmar per rättegång. Dessutom bör möss som representerar olika experimentella grupper testas tillsammans på samma nätter.
Den modulära av Lashley III labyrinten kan ändringar som syftar till att testa olika aspekter av lärande retention. Till exempel, medan förvärv sker med labyrint i en specifik konfiguration, är en gång förvärv etablerat kan labyrinten vridas så att mössen måste vända i motsatt riktning för att slutföra uppgiften, dvs att möss sväng höger kommer ut i början rutan att framgångsrikt navigera i labyrinten vid förvärv, men flexibiliteten i lärandet (minns) kan mätas genom att vrida en labyrint så att mössen ska svänga vänster ut på Start-rutan för en framgångsrik navigering. Ytterligare varianter av testet innefattar upprättande av lärande för en viss tid (vanligtvis 14 d) och sedan låter en fördröjning intervall på flera veckor, varefter behålla labyrint lärandet mäts. Retention mellanrum måste fastställas av pilotens arbete och är study-/strain-dependent. Längre utbildning tenderar att vara associerade med längre retention mellanrum. Ändringar av Lashley III labyrinten själva förfarandet är att lägga lukt signaler eller stimuli brus för att ge ytterligare motivation för en lyckad labyrint navigering. Stressfaktorer såsom återhållsamhet stress kan tillämpas vid olika tidpunkter före, under eller efter förvärvet för att utreda state-dependent inlärning och minne.
En viktig faktor att beakta vid genomförandet av Lashley III labyrint är längden på utbildningen intervallet. De flesta finns stammar av inavlade och utavlat möss, inklusive C57BL / 6, schweiziska Webster och BXD rekombinant inavlade möss, kommer att nå det lärande kriterium inom 14 dagar. Vissa stammar, särskilt CD-1 mus, når kriterium efter bara 7 dagar. Överträning av vissa stammar av möss ger avvikande beteende i labyrinten, kommer där möss börja visa en stadig och snabb ökning av antalet fel som görs varje rättegång och tid att utforska en labyrint. Figur 4 är representativt för överträning i 4-5 månader gammal hane CD-1 möss. Efter den första exponeringen mot labyrinten, institutet har vi en 15 min cut-off tid per rättegång för varje mus. Efter 15 min, musen leds genom en labyrint till pseudo-buren och fel räknas inte när 15 min varumärket har uppnåtts. Om flera möss i en kohort eller i en större studie måste leds genom en labyrint efter att ha nått att lära kriterier, kan detta vara ett tecken på överträning. För att kringgå problem med överträning och för att förkorta den totala testperioden har vi begränsat förvärvet fas till fyra försök i vissa studier och i genomsnitt lära index från den tredje och fjärde försök att bestämma en lärande poäng. Detta lärande poäng kan jämföras i stället fördagar att lära sig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla beteenden protokoll har godkänts av Pennsylvania State University Institutionella Djurvård och användning kommittén. Det finns inga finansiella upplysningar att rapportera.
Acknowledgments
Den Lashley III labyrinten används för dessa experiment byggdes av Tim Bowmaster, Paul Corman, Barry Dutrow, Ryan Jabco, och Tim Treaster från Pennsylvania State University Fysikum mekanisk verkstad. Författarna vill tacka Ms Shoba Belegundu, Ms Tara Chrzanowski, och Ms Alexandra Lewis om hjälp med att utföra experiment som presenteras i figurerna 2-4. Mr Walter Jackson gav värdefulla synpunkter vid utarbetandet av detta protokoll. Detta arbete stöddes av medel från National Institute of Mental Health (MH064756 och MH077978 till AMA). Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institute of Mental Health och National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lashley III maze | PSU Physics Machine Shop | N/A | Maze must be custom-built, not commercially available |
References
- Blizard, D. A. Return to home cage' as a reward for maze learning in young and old genetically heterogeneous mice. Comparative Med. 56, 196-201 (2006).
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse?: Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 2nd ed, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2007).
- Blizard, D. A., Klein, L. C., Cohen, R., McClearn, G. E. A novel mouse-friendly cognitive task suitable for use in aging studies. Behav. Genet. 33, 181-189 (2003).
- Warren, J. Appetitive learning by old mice. Exp. Aging Res. 12, 99-105 (1986).
- Lashley, K. Brain mechanisms and intelligence: A quantitative study of injuries to the brain. , University of Chicago Press. Chicago. (1929).
- Barnes, C. Memory deficits associated with senescence: A neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Comp. Physiol. Psych. 93, 74-104 (1979).
- Matzel, L. D. Individual differences in the expression of a general learning ability in mice. J. Neurosci. 23, 6423-6433 (2003).
- Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci. 48, 29-69 (1989).
- Hepler, D. J., Wenk, G. L., Cribbs, B. L., Olton, D. S., Coyle, J. T. Memory impairments following basal forebrain lesions. Brain Res. 346, 8-14 (1985).
- Sci, B. ehavB. rain 2, 313-313 (1979).
