Summary
Лабиринт Лэшли III является маршрут обучения задача, которая не зависит от неприятных стимулов или визуальные подсказки. Таким образом, весьма привлекательным вариантом для оценки обучения и памяти, особенно в стареющих мышей или иным образом, где стресс рассмотрения.
Abstract
Многие тесты поведения, предназначенных для оценки обучения и памяти у грызунов, особенно мышей, полагаться на визуальные сигналы, питание и / или воды лишений или других неприятных стимулов мотивации задачу приобретения. С возрастом животных, сенсорных модальностей ухудшаться. Например, многие штаммы мышей развивать слух дефицит или катаракты. Изменения в сенсорных систем, необходимых для руководства мышей во время выполнения задачи приобретения настоящий потенциал смешивает в интерпретации обучения изменения в стареющих животных. Более того, использование стимулов отвращение мотивировать животных, чтобы узнать задач является потенциально противоречащих друг мышей при сравнении с дифференциальной чувствительности к стрессу. Чтобы свести к минимуму эти типы смешанных эффектов, мы внедрили модифицированную версию лабиринт Лэшли III. Этот лабиринт зависит от маршрута обучения, при которой мышей учиться ориентироваться лабиринте с помощью многократного воздействия в условиях низкого напряжения, например, темные фазы, без еды / воды лишений, пока они не переходить пути с самого начала местом для псевдо-дома клетку с 0 или 1 ошибка (ы) в течение двух последовательных испытаний. Мы классифицируем это как с низким уровнем стресса поведение тест, потому что он не опирается на раздражители отвращение поощрять исследования лабиринта и изучение задачи. Аппарат состоит из модульных окно начала, 4-руки лабиринт тела, и цель коробки. В конце цель окно псевдо-дома клетку, которая содержит постельные принадлежности близка к найденной в доме клетку животного и специфичен для каждого животного в течение всего срока лабиринт тестирования. Было показано ранее, что это псевдо-дом клетке обеспечивает достаточную награду мотивировать мышей, чтобы научиться ориентироваться в лабиринте
Protocol
1. Способ приготовления:
- Лабиринт Лэшли III изготовлен из оргстекла и показано на рисунке 1. Начать окна лабиринта оружия, и цель окна являются модульными, чтобы обеспечить уборку и модифицируемость из лабиринта. Стены начинают окна лабиринта оружия, и цель поле построены из черного плексигласа для устранения визуальных подсказок извне и внутри лабиринта. Лабиринт руки 45 см в длину, 7 см в высоту и 5 см в ширину. Двери, ведущие к последовательным оружия из лабиринта находятся 4 см х 4 см и расположены 11 см от наружных стен лабиринта. Цель окна составляет 19,5 см в длину х 7 см х 5 см в ширину. Начать окно 8 см х 9,5 см х 7 см. Отдельные части ясно оргстекла размещены в верхней части окна начать, лабиринт, и цель поле, чтобы разрешить визуализации каждой мыши, как она прогрессирует через лабиринт, не допуская мышей от побега. Лабиринт опирается на базу, построенную из красного оргстекла, что достаточно большой, чтобы провести три части лабиринта плюс псевдо-дом клетке, что имеет те же размеры, как стандартные клетки доме животного.
- Для подготовки псевдо-клетках дома до первого судебного процесса лабиринт, свежий материал постельных принадлежностей того же рода, что и в клетках животных дома добавляется в отдельные клетки, имеющие основания дверных проемов (2 см х 2 см) нарезать сторон. Место проволоки вершины на эти клетки днища и индивидуально число их, по одному для каждого животного в тестировании когорты. Эти клетки будут служить в качестве индивидуальных дома псевдо-клетки для каждого животного в течение всего срока тестирования сроки. Потому что мы исследуем роль стресса и / или тревожное поведение, связанное с изучением и памятью, мы используем псевдо-клетках дома, чтобы избежать индивидуально жилищного мышей в своих клетках дома. Однако, если эти факторы не являются предметом главной озабоченности, животные могут быть размещены в отдельно домой клетки модифицированных дверные проемы и эти клетки могут служить домом клетки для успешной навигации лабиринте.
2. Тестирование:
- Каждый день, животные перемещаются в комнату тестирования поведения минимум за час до тестирования, чтобы они могли акклиматизироваться к среде тестирования.
- Тридцать минут до времени начала тестирования, продукты питания и вода удаляется из всех домашних клетках. Держите еду и воду в комнате поведение тестирования, но в недоступном для мышей. Пища и вода, как правило, удалены через 30 минут после перехода от легкой фазы на темную фазу, после пика кормления произошло. Это гарантирует, что животные, в основном продовольствие и воду сытый перед тестированием, однако, тестирование в этот период дает небольшую дополнительную движущей силой для перемещения по лабиринту, хотя нет открытого пищу или воду дары на выполнении задачи.
- После 30 мин предтестовая период истек, чистый лабиринт с 70% этанола. Оставьте двери, ведущей с самого начала коробку в лабиринте оружия закрыты. Двери на обоих концах цель окно остается открытым.
- Место псевдо-дом клетке соответствует первое животное в конце цель коробки.
- Провести первую мышь в лабиринте, сложив его в руке. Положите мышь в стартовом окне и закрыть крышкой.
- Когда в состоянии наблюдать лабиринт беспрепятственно открыть дверь начать ящик и сразу же запустить три секундомеры.
- Когда все четыре лапы мыши не оставили начать окно, закройте дверь начала коробку и остановить первый таймер.
- Запись вручную путь мыши путешествий, как на его борту лабиринт. Мышь входит в новую зону или руку из лабиринта, когда все четыре лапы перешли в этой области (см. рис. 1).
- Когда все четыре лапы попадает в ворота окно, закройте дверь, ведущая между лабиринтом и цель окно и остановить второй секундомер.
- Когда мышь полностью вошел псевдо-дома клетку, закрыть дверь между коробкой цели и клетку. Стоп третий секундомер.
- Запись раза из трех секундомеров. Подсчитайте количество ошибок мыши сделал. Ошибка определяется как вступление в тупик куль-де-мешок зоны (например, переходя из рук в зону L К;. Рис. 1) или в путешествии обратно через уже путешествовал руку из лабиринта (например, переход от F руку, чтобы вооружить С, рис 1).. Хотя мы и оценка мыши производительность, как это происходит, можно заснять на видео-или иную запись испытаний лабиринт, чтобы обеспечить последующее забив ни на глаз, либо автоматизированного программного обеспечения. Экспериментатор усмотрению должна быть использована для выбора соответствующего метода.
- Оставьте животное в псевдо-дом клетке в течение 1 мин, прежде чем вернуть в его родную клетку.
- Повторите шаги с 2,3 до 2,12 для всех мышей в тестировании когорты.
- Когда последняя мышь в когорте был возвращен в исходное клетке, начинаются 30 Таймер мин. В конце этого периода 30 мин, возвращение пищи и воды для всех мышей в когорте, а затем вернуться к своим животным колонии комнату.
- Повторите эту процедуру на ночей подряд, в одном испытании в день тестирования на одно животное, пока все мыши в когорте достигли определенных критериев обучения или до заданной нхариус тестовых испытаний произошло. Мышь классифицируется как узнав лабиринт, когда он может выполнять задачи с 0 или 1 ошибка (ы) в течение двух последовательных испытаний. Мыши проходят испытания в том же порядке при последующих испытаниях.
3. Представитель Результаты:
Дней, чтобы узнать (достигают критерия) могут быть проанализированы и сравнены между различными группами в конкретном исследовании (рис. 2а и 3а). Кроме того, обучение индекс (соотношение обучения), которая характеризует лабиринт приобретения, могут быть оценены в течение первых четырех дней тестового периода (рис. 2B и 3B). Обучение индекс представляет собой отношение количества правильных сегментов пути, пройденного к общему количеству сегментов контура путешествовал для каждого испытания. Средний показатель обучения должна быть примерно 0,5 в суд 1, когда мыши сначала выставлен лабиринт и навигации случайно. Обучение индекс растет и приближается к 1 между испытаниями 2, а 4 указывает, что обучение происходит. На рисунке 2 молодых (2 месяца) и старение (24 месяцев) мышей-самцов C57Bl/6NCr прошли обучение по лабиринту Лешли на срок до 15 испытаний. Молодых мышей научились лабиринт в 7,2 (± 1,5) d. В отличие от стареющих животных взяли 11,7 (± 2,1) г для достижения критерия. Был сильный тренд для стареющих мышей C57Bl/6NCr занимает больше времени, чтобы узнать лабиринт ([т (23) = 1,59, P = 0,056]; односторонний т-тест, априори, что гипотезы дней, чтобы узнать больше, в процессе старения мышей). При обучении индекс рассчитывается, обеих возрастных группах свидетельствуют о неуклонном увеличении обучения индекс из испытаний с 2 по 4 (основной эффект значительного времени, P <0,001). Тем не менее, не было статистически значимых различий в обучении между молодыми индексом C57 мышей и старых мышей C57 (основное влияние возраста P = 0,58).
На рисунке 3 представителя исследования по изучению последствий фоне нагрузки на изучение поведения. Данные из молодых мужчин C57Bl/6NCr показано на рис. 2 в настоящее время по сравнению с данными из молодых Crl: CD-1 (ICR) BR мышей [CD-1, 4-5 движения]. CD-1 мышей научились лабиринтом Лешли III в 4,5 (± 1,4) г, однако, не было никакого существенного различия между штаммами в днях, чтобы узнать (рис. 3А; [т (18) = 1,328, P = 0,20], два хвостами т-тест). В отличие от этого, экспертиза обучения индекс показывает, что, в то время как все животные были навигации лабиринте на первом процессе случайно, CD-1 мышей научились задачей быстрее (основной эффект деформации Р <0,001). Об этом свидетельствует статистически значимое повышение индекса обучения в испытаниях со 2 по 4 в CD-1 мышей по сравнению с C57Bl/6NCr мышей. Интересно, что если CD-1 мышей продолжат обучение в лабиринте за точку достижения критерия, они демонстрируют поведение свидетельствует о перетренированности (рис. 4), которая обсуждается более подробно ниже.
Рисунок 1:. Лабиринтом Лешли III тупиковый куль-де-мешок зон лабиринт окрашены в красный цвет в этой схеме только для иллюстрации. Базы и вооружения фактически лабиринт твердых цветах (вставка). Лабиринт в масштабе (размеры в тексте).
Рисунок 2: Лэшли III лабиринт производительности в 2-х и 24-месячный мальчик мышей C57Bl/6NCr лабиринт Лэшли III была использована для оценки маршрутов обучения в молодых (2 месяца) и старение (24 месяцев) мышей-самцов C57Bl/6NCr.. Измеряемых параметров были () дней с критерием, количество дней, необходимых для мыши для запуска лабиринт в течение двух последовательных ночей с 0 ошибок или 1 ошибка, и (б) обучение индекса, количество правильных четыре лапы записей руку сделанные против общего количества руки записи, сделанные в дни 1-4 из Лэшли тестирования лабиринт III. Число животных в каждой группе были п = 10 в течение 2 месяцев от роду и п = 15 для 24 месячных мышей.
Рисунок 3: Лэшли III лабиринт производительности среди молодых мужчин, C57Bl/6NCr и CD-1 мышей лабиринт Лэшли III была использована для оценки маршрутов обучения в 2-х месячного C57Bl/6NCr и 4-5 месячного CD-1 мышей.. Измеряемых параметров были () дней с критерием, количество дней, необходимых для мыши для запуска лабиринт в течение двух последовательных ночей с 0 ошибок или 1 ошибка, и (б) обучение индекса, количество правильных четыре лапы записей руку сделанные против общего количества руки записи, сделанные в дни 1-4 из Лэшли тестирования лабиринт III. Число животных в каждой группе были п = 10 для C57Bl/6NCr и п = 10 для CD-1 мышей. Статистические значимости: * P <0,05, ** P <0,01 в сравнении с C57Bl/6NCr мышей.
Рисунок 4: Лэшли III лабиринт производительности в 4-5 месячный мальчик CD-1 мышей лабиринт Лэшли III.была использована для оценки маршрутов обучения в десять 4-5 месячный мальчик CD-1 мышей на 15 дней подряд. Измеряемых параметров были (а) количество ошибок, допущенных в день, с сообщением об ошибке определяется как четыре лапы вступления в тупиковых куль-де-мешок зоне или в путешествии уже путешествовал рукой лабиринт, и (б) Время, проведенное в лабиринте в день. День, при котором критерием была достигнута обозначается красной стрелкой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее часто используемые грызунами поведенческие тесты для оценки обучения и памяти лабиринте Морриса воды и варианты страх кондиционирования 2. Эти тесты полагаться на визуальные или слуховые сигналы для обучения и отвращение стимулы (например, вода, footshock) мотивировать животных для выполнения задач 3. В старения грызунов, а в процессе старения человека, сенсорные модальности со временем уменьшается. Несколько штаммов фоне мышей теряют слух или катаракта, поскольку они стареют, и смертности после 23,5 ч воды лишения Было показано, что увеличение мышей, поскольку они стареют 4. Таким образом, изменения в производительности в этих более широко используются тесты могут быть трудно интерпретировать в стареющих грызунов.
Лабиринт Лэшли III впервые был описан Карл Лешли в 1929 году 5. Лешли использовать эту парадигму для поиска памяти энграммы в коре головного мозга корковой использованием методов lesioning. Мы несколько изменили первоначальный лабиринт, чтобы обеспечить его широкое применение для исследований с участием старения грызунов. Мы устранили пищевой подают реплики навигации лабиринте и показали, что псевдо-дома клетку среда обеспечивает достаточную мотивацию для молодых и старых мышей ориентироваться в лабиринте 1. Другие исследователи также использовали награду пищи гранулы для облегчения процесса обучения из лабиринта Лэшли III 7. Визуально-навигации подают реплики, как и требуется в лабиринте Морриса водой и лабиринт Барнс круговой, было сведено к минимуму 2,6,8. Мыши не лишены пищи до 90% своего веса, как это требуется в течение нескольких вариаций радиальной лабиринт руку, Y-лабиринт и Т-образном лабиринте задач 2,9-10. Скорее всего, пища и вода доступна без ограничений животных и удаляется только за 30 минут до каждого тестирования суд с тестированием обычно происходит во время активной фазы темно. Пища вернулся через 30 минут после последнего мыши в когорте выполнила задачу, и диссоциирован временно от возвращения в псевдо-дома клетку, чтобы не выступать в качестве открытой награду за выполнение задания. Важно отметить, что отсутствие воды и пищи для всей когорты не должна выходить за период 4-5 ч в суд. Кроме того, мыши, представляющих различные экспериментальные группы должны быть проверены вместе на одной ночи.
Модульность лабиринт Лэшли III позволяет изменять предназначена для проверки различных аспектов обучения хранения. Например, при приобретении происходит с лабиринтом в конкретной конфигурации, когда приобретение установлено, лабиринт может быть повернута так, что мыши, должны обратиться в обратном направлении для выполнения задачи, то есть, мыши будет повернуть направо выходит из начала окне чтобы успешно ориентироваться в лабиринте во время приобретения, но гибкость обучения (напомним) может быть измерена вращающиеся лабиринт так, что мыши должны повернуть налево из начала коробка для успешной навигации. Дополнительные изменения процедуры испытания включают в себя создание обучения в течение определенного периода времени (обычно 14 дней), а затем позволяет задержки интервалом в несколько недель, после чего сохранение лабиринт обучения измеряется. Сохранение интервалы должны быть созданы на экспериментальной работы и study-/strain-dependent. Более тренинги, как правило, связано с более длительными интервалами хранения. Модификации лабиринтом Лешли III самой процедуры включают в себя добавление запаха сигналы или помехи стимулы для обеспечения дополнительной мотивацией для успешной навигации лабиринте. Стресса, такие как сдержанность стресс может быть применен в разное время, до, во время или после приобретения для расследования состояния зависят от обучения и памяти.
Важным фактором при реализации лабиринт Лэшли III является длительность интервальной тренировки. Большинство имеющихся штаммов инбредных и беспородных мышей, в том числе C57Bl / 6, швейцарские Вебстер, и BXD рекомбинантных инбредных мышей, достигнет критерий обучения в течение 14 дней. Некоторые штаммы, особенно CD-1 мышей, достигают критерия уже через 7 дней. Перетренированность некоторых линий мышей вызывает аномальное поведение в лабиринте, в котором мышь начнет показывать устойчивый и быстрый рост числа ошибок, допущенных в суд и время, проведенное исследование лабиринта. Рисунок 4 является представителем перетренированности в 4-5 месячный мальчик CD-1 мышей. После первого контакта с лабиринтом, мы институте 15 минут крайний срок в суд для каждой мыши. Через 15 минут мыши проходит через лабиринт, чтобы псевдо-дома клетку и ошибки не учитываются один раз 15 мин марка была достигнута. Если несколько мышей в группе или в более крупном исследовании должны быть проложены в лабиринте после достижения критериев обучения, это может быть признаком перетренированности. Чтобы обойти проблемы с перетренированности и сократить общую продолжительность теста, мы ограничились приобретением фазы четыре исследования, в некоторых исследованиях и в среднем обучение индекс из третьего и четвертого испытания, чтобы определить обучения балла. Это обучение оценка можно сравнить на местедней, чтобы учиться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все поведение протоколы были одобрены Университета штата Пенсильвания Институциональные уходу и использованию животных комитета. Есть никаких финансовых раскрытий в отчете.
Acknowledgments
Лабиринт Лэшли III используются для этих исследований была построена Тим Bowmaster, Пол Корман, Барри Dutrow, Райан Jabco, и Тим Treaster из Университета штата Пенсильвания физики Магазин машина департамента. Авторы хотели бы поблагодарить г-жу Шоба Belegundu, г-жа Тара Chrzanowski, и г-жа Александра Льюис за помощь в проведении экспериментов представлены на рисунках 2-4. Г-н Вальтер Джексон ценную обратную связь в подготовке этого протокола. Эта работа была поддержана финансирование из Национального института психического здоровья (MH064756 и MH077978 к АМА). Содержание несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института психического здоровья и Национального института здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lashley III maze | PSU Physics Machine Shop | N/A | Maze must be custom-built, not commercially available |
References
- Blizard, D. A. Return to home cage' as a reward for maze learning in young and old genetically heterogeneous mice. Comparative Med. 56, 196-201 (2006).
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse?: Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 2nd ed, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2007).
- Blizard, D. A., Klein, L. C., Cohen, R., McClearn, G. E. A novel mouse-friendly cognitive task suitable for use in aging studies. Behav. Genet. 33, 181-189 (2003).
- Warren, J. Appetitive learning by old mice. Exp. Aging Res. 12, 99-105 (1986).
- Lashley, K. Brain mechanisms and intelligence: A quantitative study of injuries to the brain. , University of Chicago Press. Chicago. (1929).
- Barnes, C. Memory deficits associated with senescence: A neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Comp. Physiol. Psych. 93, 74-104 (1979).
- Matzel, L. D. Individual differences in the expression of a general learning ability in mice. J. Neurosci. 23, 6423-6433 (2003).
- Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci. 48, 29-69 (1989).
- Hepler, D. J., Wenk, G. L., Cribbs, B. L., Olton, D. S., Coyle, J. T. Memory impairments following basal forebrain lesions. Brain Res. 346, 8-14 (1985).
- Sci, B. ehavB. rain 2, 313-313 (1979).
