Summary
Aqui nós descrevemos um método detalhado para o cultivo primário células epiteliais brônquicas humanas a partir de explantes de tecido das vias aéreas brônquicas humanas incluindo o crescimento diferenciado em uma interface ar-líquido. Este método fornece uma fonte abundante de células primárias para investigar o papel do epitélio das vias aéreas pulmonares em saúde humana e doenças.
Abstract
Células epiteliais brônquicas humanas são necessários para os modelos de celular da doença e para investigar o efeito de excipientes e agentes farmacológicos sobre a função e estrutura de células epiteliais. Aqui nós descrevemos em detalhe o método de cultivo de células epiteliais brônquicas tecido das vias aéreas brônquicas que é colhida pelo cirurgião na hora da cirurgia de pulmão (câncer de pulmão por exemplo, ou cirurgia redutora de volume). Com a ética aprovação e consentimento informado, o cirurgião leva o que é necessário para a patologia e nos fornece uma porção brônquica que é remota a partir das áreas doentes. O tecido é então usado como fonte de explantes que podem ser usados para o cultivo de células epiteliais brônquicas primária em cultura. Segmentos brônquica cerca de 0,5 a 1 cm de comprimento e um centímetro de diâmetro ≤ são lavados com EBSS frio e do tecido parenquimatoso em excesso é removido. Segmentos são cortadas e picadas em 2-3mm
Protocol
Humana segmentos brônquica proporcionar uma fonte abundante de células epiteliais brônquicas principal. Neste artigo descrevemos um protocolo para o crescimento e expansão da Human brônquica epiteliais (HBE) células de recém-humano isolado segmentos brônquica. Este protocolo consiste em cinco seções:
- Revestimento e Coçar placas de cultura 100 milímetros
- Preparando Explantes tecido brônquico
- Brônquica transplantes de tecidos
- Passagem de células HBE
- Células ciliadas crescente HBE em Transwells
Antes de começar a Nota que todas as etapas são feitas em cabine de segurança biológica (CSB) salvo indicação contrária. Por favor, certifique-se que todos os materiais necessários para este procedimento. Por favor, leia os materiais, reagentes e seção de Preparação e certifique-se que você tem assepticamente (ou seja, em uma cabine de segurança biológica ou BSC) preparou o seguinte:
Solução de revestimento de ações: fibronectina (10 mcg / ml), BSA (10 mcg / ml) e colágeno (30 mcg / ml) em solução salina balanceada de Earle s (EBSS, estéril).
Meio de Cultura: DMEM / Ham F-12 com aditivos, antibióticos antimicótica (1%) e FBS (1%)
Dissociação soluções: Tripsina / EDTA solução de reserva e DMEM/F-12 com FBS (10%)
1. Revestimento e Coçar placas de cultura 100mm explantes serão semeadas em placas de cultura de 100mm. Comece por placas de revestimento de 100 milímetros de cultura com solução de revestimento. Isto deve ser feito no BSC, manter tudo esterilizado.
- Coloque placas de cultura estéreis 100mm e solução de revestimento (colágeno / fibronectina / BSA) no BSC.
- Pipetar 2,0 ml da solução de revestimento em uma placa de 100mm.
- Giram em volta para revestir a base do prato. Verifique se a solução de revestimento cobre a base do prato uniformemente.
- Pipetar a solução restante fora e usá-lo para revestir uma segunda placa de 100mm. Repita o procedimento para que as placas que forem necessárias. O número de placas necessárias varia de acordo com o número de explantes de tecido.
- Verifique se a solução de revestimento cobre as bases das placas uniformemente, como demonstrado.
- Cobrir as placas com suas capas. Permitir que as placas para secar na incubadora por 1-2 horas e aspire o excesso de solução antes do uso de explantes de tecido dos brônquios. Não utilizadas placas de cultura revestido pode ser colocado em um saco estéril; selados e armazenados a 4 ° C para uso posterior (pode ser armazenado até um mês na geladeira). Trazer à temperatura ambiente antes de usar.
- Spray de limpa pequena tesoura afiada, bisturi e pinças com etanol 70% e pôr em BSC. Zero placas revestidas pressionando firmemente com bisturi para formar pequenos profunda X s (pelo menos 4). Se o zero não é profundo o suficiente, pedaços de tecido não vai resolver em sulcos e irá flutuar.
2. Preparando Explantes tecido brônquico
Use tecido brônquico obtidos dentro de 24-36 horas após a cirurgia. Manter o tecido no gelo em EBSS até que esteja pronto para uso.
- Fora do BSC: tecido Coloque em um prato de Petri. Lavar o humano isolado amostras de tecido dos brônquios completamente em EBSS.
- Dissecar tecidos circundantes excesso.
- Cortar as peças brônquica.
- Trazer tecidos para o BSC e transferir para uma placa de cultura de tecido estéril com 100 milímetros DMEM/HamF12 frio + 1% antibiótico / antimicótico.
- Use a pequena tesoura afiada para cortar o tecido em 2-3 mm 3 peças.
- Coloque um pedaço de tecido cortado no centro de cada X com uma pinça e pressione suavemente.
- Deixe os pedaços de tecido (explantes) aderir à placa por alguns segundos, e então suavemente adicionar 10 ml de meio completo (DMEM/HamF12 + aditivos +1% antibiótico / antimicótico + FBS 1%). Se o tecido flutua após a adição de mídia, use uma pinça para empurrar o tecido para os cumes do X ou fazer uma nova X. Pode ser necessário fazer novos X s se os sulcos não são profundas o suficiente.
- Placas lugar na incubadora e mídias mudam a cada 3-4 dias.
- Tecidos estão prontos para transplante quando suficientes células epiteliais têm crescido em torno de explantes de tecido para cobrir 1-2cm áreas. Isso leva aproximadamente quatro semanas.
3. Brônquica transplantes de tecidos
- Use 100 milímetros placas revestidas e arranhado. Uma vez que alguns explantes de tecido pode não ser bem sucedida, o número de placas depende de quantos pedaços de tecido que você está transplante. Se você estiver usando placas que tenham sido previamente revestidas e armazenadas a 4 ° C, trazer à temperatura ambiente antes de usar.
- Utilizando uma pinça, com cuidado, pegue o tecido da placa original e colocar no centro de X s na placa nova, e pressione suavemente. Tecidos sem conseqüência deve ser descartada.
- Deixe o tecido aderir a placa por alguns segundos, adicionar mídia e incubar ouvido como descritolier de explantes (2,7-2,9).
4. Passagem de brônquicas humanas epiteliais (HBE), as células
- Descongelar 2 ml de tripsina / EDTA solução estoque para cada placa de 100 milímetros de cultura de tecidos. Diluir estoque com 6ml de 0,01 M PBS estéril (ou seja, adicionar 2 ml de solução a 6 ml de PBS (concentração final de tripsina é de 250 mcg / ml e para EDTA é de 100 mcg / ml).
- Depois de se mudar explantes para um novo prato, aspirado de mídia de placas com 1-2cm anéis de células.
- Adicionar 8ml de solução diluída aquecido Tripsina / EDTA para cada placa de 100mm e lugar em incubadora (37 ° C) por 3-15 minutos. Verifique com freqüência, deixando de tripsina por muito tempo pode danificar as células.
- Verifique as placas sob um microscópio para ser certo que a maioria das células têm sido levantadas. Células vão arredondar para cima e retire como mostrado.
- Adicionar 8ml de aqueceu 10% FBS em media por placa de inativar a solução de tripsina / EDTA.
- Combine volumes de todas as placas em um tubo (ou tubos separados se diferentes tecidos). Contagem de células utilizando um hemocitômetro.
- Centrifugar a 100 g por 5 minutos. A pelota célula irá formar na base do tubo.
- Re-suspender pellet celular na mídia completo (DMEM / Ham F12 + todos os aditivos + 1% antibiótico antimicótico + 1% de SFB) na concentração de células desejado.
- Coloque cada 2-3000000 células por T75 frasco e adicionar mídia completo, conforme necessário. Incubar e mudança de mídia a cada 3-4 semanas. Células crescem a sub-confluência (80-90%) em frascos de T75 em cerca de 4 semanas. As células devem ser levantadas e expandido ou usado em sub-confluência para evitar a senescência.
5. Crescimento epitelial ciliado Humanos brônquica (HBE) células em Transwells.
Primárias células epiteliais cultivadas a partir de explantes de tecido / transplantes, pode ser expandida até três vezes, e então usado. A densidade de semeadura de 50.000 a 100.000 células por cm 2 é recomendado 1,2. Maior densidade promove a rápida diferenciação.
Nota: Preparar uma suspensão de células e medir seus números. Re-suspender em meio de cultura menos 1 milhão de células por 2ml.
- Começar a preparar as membranas permeáveis do transwells por pré-incubação as inserções de cultura de células com o meio (DMEM / Ham F12) antes do uso. Esta etapa é necessária com essas células sensíveis e ajudará adesão celular.
- Use os 6,5 milímetros inserções que se encaixam na 24 bem vários pratos bem.
- Adicionar média para ambos os lados da membrana (para 6,5 mm, use 0,6 ml insere na parte inferior, 0,1 ml em cima). Incubar 1 hora em cultura de células incubadora.
- Remova cuidadosamente (aspirado), a média de ambos os lados da membrana começando com o volume basal primeiro.
Cuidado significa: a membrana pode ser facilmente danificada, por isso pipeta o meio para o lado da inserção da cultura, use o volume recomendado. Não fazer isso irá resultar em vazamento ao longo da mídia para outros poços.
- Células descendência depois de Pré-incubação de Apoio Permeável
- Pipetar cuidadosamente a sua suspensão de células no lado apical da membrana: para poços de 6,5 milímetros adicionar 0,1 ml de suspensão de células (ou seja, 50.000 células) para o lado apical da membrana.
- Pipetar 0,6 ml médio do lado da membrana basal.
- Alimentar as células a partir dos lados apical e basal por 10 dias para estabelecer uma cultura bem diferenciados: meio de troca duas vezes por semana usando o método demonstrado:
- Remover volume basal primeiro
- Substituir o volume apical (0,1 ml médio)
- Adicionar 0,6 ml de meio para o lado da membrana basal.
Este método promove a adesão celular a membrana e evita que as células sejam expostos ao ar por longos períodos de tempo (troca de mídia rapidamente e colocar de volta na incubadora). - Criar uma interface ar-líquido (ALI) no dia 10, removendo o meio apical, em seguida, substituir os 0,6 ml do meio no lado basal da membrana.
- Manter as células em ALI por 6 semanas, a mudança media duas vezes por semana. Células ciliadas começarão a aparecer 4 semanas após a criação do ALI. Células vão alcançar uma diferenciação em células ciliadas uniforme 6 semanas após a criação do ALI.
Preparação de materiais:
1. Preparação da solução de reserva de revestimento (fazer isso no BSC):
Primárias células epiteliais brônquicas humanas crescem bem em superfícies revestidas com fibronectina / BSA / colágeno 3. A solução estoque de revestimento é usado para placas de 100 milímetros de cultura de tecidos para transplante de explante e culturas, como descrito acima. Também a solução de revestimento pode ser usado em lamínulas de revestimento para acelerar a adesão celular, as lamelas pode então ser utilizado para a imunocoloração experimentos.
- Fibronectina (1mg/ml solução estoque): Use F2006-2mg de Sigma. Dissolver 2mg em 2mls de solução estéril Earle s salina balanceada (EBSS, Sigma 28.888), filtro com 0,2 mM de filtro de seringa no Gabinete de Segurança Biológica (CSB). 1ml armazenar no freezer -20 ° C para uso posterior, e use 1 ml para preparar um mls 100 de solução de revestimento.
- BSA (1mg/ml solução estoque): Use Sigma A4919-1g. Pesar 20 mg BSA e dissolver em 20 mls EBSS estéril, filtro com 0,2 mM filtro de seringa no BSC. Alíquotas em frascos de 1 ml e armazenar no freezer -20 ° C até ser necessário. Use 1 ml de ações para tornar 100mls de solução de revestimento.
- . Colágeno solução-mãe (fornecido como 0,1% ou 1mg/ml de Sigma C8919) Nota: aberto somente no BSC e vedação antes de retornar à geladeira. Use 3 ml de ações para fazer 100 ml de solução de revestimento.
- Solução de revestimento de ações: No BSC: adicionar colágeno 3mls (1mg/ml) para 1ml fibronectina (1mg/ml) e BSA 1 ml (1mg/ml), mais 95 mls EBSS (estéril). Misture bem e alíquota em 2 frascos ml e armazenar no freezer -20 ° C até ser necessário. Concentração final na solução estoque de revestimento: fibronectina (10 mcg / ml), BSA (10 mcg / ml) e colágeno (30 mcg / ml) em EBSS.
2. Preparação de meio de cultura (preparar na BSC): Médio consiste em DMEM / Ham F-12 da Sigma com extrato de hipófise bovina (15 mg / ml) e fator de crescimento epidérmico (10 ng / ml) com outros aditivos, conforme indicado abaixo. Antibiótico / antimicótico (1%) e FBS (1%) são adicionados recentemente toda vez que o meio de cultura é alterada. Este meio foi compilado através da revisão de vários métodos que descreviam as culturas de células epiteliais das vias aéreas 3-9. Nosso meio é destinado para o crescimento ideal de células epiteliais brônquicas humanas.
- Extrato de hipófise bovina (BPE solução estoque 1mg/ml): Sigma P1476 (2,5 ml BPE em 14mg/ml solução estéril e filtrada): Diluir 2,5 ml do estoque (14mg/ml) para uma concentração final de 1mg/ml. ou seja, adicionar 2,5 ml de ações BPE a 32,5 ml de EBSS estéril para um estoque de 1mg/ml. Dividem-se em 7,5 ml alíquotas (4 tubos de 7,5 ml alíquotas e um tubo de 5 ml alíquota). Após a diluição, alíquotas de armazenar a -20 ° C até ser necessário. Armazenamento prolongado do produto reconstituído e repetidos de congelamento e descongelamento não são recomendados.
- Fator de crescimento epidérmico (EGF solução estoque 10 mg / ml): 0,2 mg-Sigma E9644. Reconstituir o conteúdo (0,2 mg) em 20 mM de ácido ms de 0,2 mm filtrada 10 acético contendo 0,1% de BSA (ou seja, dissolver 20 mg BSA em 20 ml de 10 mM de ácido acético e filtro, em seguida, usar para reconstituir EGF). Alíquota em 0,5 ml alíquotas e armazenar no freezer -20. Use 100μl para 100 ml de mídia.
- Epinefrina (5mg/ml solução stock): E1635 Sigma. Dissolver 10 mg em 2 ml de ácido clorídrico 1M filtrada (HCl), alíquota em 50 frascos mL e congelar (-20 ° C).
- Insulina (2mg/ml solução estoque): Sigma I6634 50mg. Dissolver 50mg em 25ml filtrada (filtro de 0,2 Hm) diluída de HCl (1mM). Alíquotas em frascos 1.25ml.
- Tranferrin Humanos (50 mg / ml solução estoque): Sigma T8158 100mg. Dissolver 100mg em 2ml Dh20 (filtrado com filtro de 0,2 mm). Alíquota de 100μl cada (0,5 ml em frascos).
- Triiodo-L-thyronine (1mg/ml solução estoque): Sigma T6397 100mg. Dissolver 100mg em 100ml filtrada 1M HCl. Alíquota em alíquotas de 1ml. 0,5 ml da alíquota em alíquotas 10μl.
- Hydorcortisone (5mg/ml solução estoque):. Sigma H0888 Pesar 100mg e dissolver em etanol filtrada 20ml de ações 5mg/ml. Alíquota para frascos de 1ml. Dividir um 1ml (5mg/ml) para 50μl alíquotas (0,5 ml frascos).
- Ácido retinóico (1mg/ml solução estoque, diluído para 0.01mg/ml quando utilizado): Sigma R2625 100mg). Dissolver 100mg em 10ml de etanol. Divide a alíquotas 1,0 ml. Divide frasco (1 ml) para 50 tubos de 20μl cada. Congelar a -20 ° C. Pegue um frasco e diluir a 20μl 2000μl com a mídia para um estoque de 0.01mg/ml quando necessário.
- Solução de albumina de soro bovino, cultura de células estéreis filtrado, testado: Sigma A8412. Solução de armazenamento no frio (4 ° C) até ser necessário. Aberto somente no BSC.
- Antibiótico antimicótico, Sigma A5955: alíquota para volumes de 1 ml e congelar a -20 ° C até ser necessário. Use a 1% concentração final no meio.
- FBS, Sigma F1015: Inativar FBS a 50 ° C por 30 minutos. Deixe esfriar na BSC. Alíquota em 1 ml e 10 ml frascos estéreis. Use a 1% de concentração final no meio de cultura e em 10% concentração final na mídia para neutralizar Tripsina / EDTA.
- Constituição de meio de cultura:
Para500 ml de uso DMEM/HamF12 médio:- 1 tubo de BPE (cada 7.5ml de 1mg/ml) para uma concentração final de 15μg/ml.
- 1 tubo de EGF (0,5 ml de 10μg/ml) para uma concentração final de 10ng/ml.
- 1 tubo de epinefrina (50μl de 5mg/ml) para uma concentração final de 0.5μg/ml.
- 1 frasco de Insulina (1.25ml de 2mg/ml) para uma concentração final de 5μg/ml.
- 1 frasco de Transferin (100μl de 50mg/ml) para uma concentração final de 10μg/ml.
- 5 mL de Triiodo-L-thyronine (a 1mg/ml) para uma concentração final de 10ng/ml.
- 1 frasco de hidrocortisona (50μl de 5mg/ml) para uma concentração final de 0.5μg/ml.
- 5 mL de ácido retinóico diluído para 0.01mg/ml para uma concentração final de 0.1ng/ml.
- Solução de 10 mL de albumina de soro bovino para uma concentração final de 1.5μg/ml
3. Preparação de dissociação Solutions:
- Preparação de Tripsina / EDTA solução estoque: dissolver 100 mg de tripsina (Sigma T9935-100mg) e 40mg EDTA (Sigma E6758) em 500 ml PBS 0,01 M (Sigma E6758). . Alíquotas em frascos de 2ml e armazenar no freezer -20 ° C Solução diluída de ações: adicionar 2 ml de solução a 6 ml de PBS (concentração final de tripsina é de 250 mcg / ml e para EDTA é de 100 mcg / ml).
- Solução para parar reações enzimáticas: Prepare fresca a 10% FBS em mídia no BSC: adicionar 1 ml a 9 ml FBS media (DMEM / Ham F-12). Para cada placa de 100 milímetros usar 8 ml de aqueceu 10% FBS para neutralizar 8 ml da solução de dissociação.
4. Requisitos especiais:
- Células epiteliais quando cultura, que você precisa para manter tudo limpo e desinfetado. Todos os reagentes utilizados para cultura de células deve ser estéril ou filtrada com filtro de 0,2 Hm. Preparação de materiais e aditivos deve ser feito em uma câmara de segurança biológica (CSB). Mídia adição ou mudança de mídia deve ser feito em um BSC.
- Tie cabelo longe, usar uma touca descartável se disponível, e usar uma bata de laboratório e luvas.
- Manter todas as superfícies de trabalho livre da desordem. Limpe as superfícies de trabalho com etanol 70% entre as operações e permitir um mínimo de 15 minutos entre a manipulação de diferentes culturas.
- Rotular todos os reagentes e garrafas de mídia, incluir data de recebimento e data preparado.
- Examine as culturas e meios de comunicação regularmente para a evidência de contaminação bacteriana ou fúngica grave.
- Teste regularmente para micoplasma (se necessário)
- Warm up meio de cultura a 37 ° C antes de mudar de mídia sobre as células.
- Antibióticos / antimicóticos e FBS deve ser recentemente adicionado ao meio.
- Mudança média pelo menos a cada 3-4 dias. Não deixe que as células se sentar à temperatura ambiente por um longo tempo. Mudança de mídia e imediatamente devolver à incubadora.
Resultados representativos:
Características da cultura e morfologia de células epiteliais brônquicas humanas
Microscopia de células epiteliais brônquicas humanas escovado dos segmentos brônquicos utilizado para a cultura, antes do cultivo, demonstrou tiras de ambas as ciliadas e não ciliadas células epiteliais, indicando um epitélio normal (Figura 1, Suplemento 1). Imunomarcação de preparações cytospin de células a partir de explantes e as células semeadas em lamínulas revelou que todas as células foram positivas para as citoqueratinas epitélio-específico (Figura 3). Culturas de sucesso a partir de explantes de tecido dos brônquios ocorreu em 8 dos 9 tecidos, como uma das culturas de explante foi infectado. Os anéis de células epiteliais atingido 1-2 cm de raio em 3-4 semanas (Figura 2a). Explantes foram cultivados sucesso novamente até 6 vezes. Em todas as culturas de sucesso, não havia provas de migração celular dentro de 48 horas de iniciar o transplante (Figura 2b). Células tinham uma aparência de pedras que é distinta para essas células epiteliais, como mostrado nas Figuras 2, 4, 5 e 6. Sub-cultura de células brônquica mostrou imunomarcação positiva para citoqueratina uniforme e caderina-E. Imunomarcação com anticorpos específicos contra outros tipos de células não mostram qualquer indicação de contaminação de culturas por fibroblastos, mesenchymal células, ou endotelial (α-SMA, vimentina e CD31: PECAM-1 manchas respectivamente) (Figura 5). Células cultivadas em membranas permeáveis de poliéster (transwells) com ar-líquido interface diferenciada para epitélio ciliado como demonstrado na Figura 6. Gravações de vídeo representativas das células epiteliais brônquicas cultivadas em transwells demonstrar um epitélio diferenciado com o batimento dos cílios (Suplemento 2).
Características do ser humano brônquica culturas de células epiteliais testados são apresentados na Tabela 1. O tempo médio para a primeira passagem (P1) foi de 4 semanas, eo rendimento médio foi de 15,1 ± 2,75 milhões de células (n = 9 tecidos). A viabilidade das células a partir de explantes e no P1 foi avaliada por exclusão de tripan azul, e foi sempre elevado (99%) nestas culturas brônquica. Sub-cultura de células das culturas de explantes de cada tecido foram agrupados após a primeira passagem para uso posterior. O número de células significa recuperados a partir de explantes foi significativamente maior do que a cultura subseqüente Passagem (a cada 2 milhões de células a partir de P1 rendeu P2: 6,75 ± 2,4 milhões de células, tecidos n = 5). Uma cultura P2 foi descartada como a morfologia não era típica de células epiteliais (Figura 7a). Da mesma forma, outras duas passagens (P2 e P3) de diferentes tecidos (Figura 7b) foram descartados.
Figura 1 Humanos segmentos de tecido dos brônquios e uma faixa recém-isoladas epitelial de células ciliadas e não ciliadas. (A) Representante da imagem humana segmentos de tecido dos brônquios - ~ 1-2cm de comprimento e <1 centímetro de diâmetro utilizadas para culturas primárias de células epiteliais brônquicas humanas. (B) Uma faixa de células epiteliais brônquicas humanas escovado do segmento brônquica demonstra tanto ciliadas e não ciliadas células epiteliais, 320X ampliação. Vídeo de células com o batimento dos cílios é fornecido como suplemento 1.
Figura 2 células epiteliais brônquicas humanas cultivadas a partir de explantes em placas de cultura de tecidos 100 milímetros. a) placa de 100mm com 2-3mm3 tecido. Observe o anel de células de cerca de 1-2cm, que se torna visível a olho nu, após 3-4 semanas. b) Imagem da borda do tecido do explante e as células epiteliais à medida que migram a partir do explante, bar = 100μm. Explantes transferidos para um novo prato transplantes de se tornar. Explantes podem ser transplantadas até 6 vezes.
Figura 3 Células cultivadas a partir de explantes coradas para epitélio citoqueratinas específicas. Cytospins de células a partir de explantes foram coradas para citoqueratinas (verde) com o monoclonal anti-citoqueratina Pan-FITC (mistura), que reconhece humana citoqueratinas 1, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18 e 19. Núcleos foram corados com Hoechst mancha (azul). A imagem mesclada demonstra que as células dos brônquios cultivadas a partir de explantes foram principalmente as células epiteliais, Bar = 20Hm.
Figura 4 Sub-cultura de células epiteliais brônquicas humanas. a) Uso de tripsina / EDTA, as células a partir de explantes e transplantes são levantadas a partir das placas 100 milímetros, contados e semeado a 2-3 milhões de células por frasco T75. Células crescem a sub-confluência (80-90%) em frascos de T75 em 28-30 dias (b, c). Observe a morfologia típica de paralelepípedos das células epiteliais, Bar = 100μm.
Figura 5 Sub-cultura de células bronquiais foram verificados como imunomarcação utilizando epiteliais. Estas células coradas positivo (verde) para citoqueratina-FITC (a, b), um controle positivo para citoqueratina-FITC é mostrado em células epiteliais A549 (c) e um controle negativo é demonstrado em fibroblastos (d). Cultura de células manchadas brônquica positiva (vermelho escuro) para E-Cadherin/Alexa Fluor 594 (i, j), e não mancha para α-SMA-Cy3 (e, f), Vimentina / TRITC (m), nem CD31 (PECAM -1/FITC) (o) indicando que não houve contaminação dos primários cultivados com células epiteliais brônquicas músculo liso, mesenquimais ou células endoteliais, respectivamente. Controle positivo (vermelho escuro) para E-Cadherin/Alexa Fluor 594 é demonstrada em células epiteliais A549 (k). Controle positivo para α-SMA-Cy3 (vermelho) é demonstrada em fibroblastos (g, h). Controles anticorpo secundário são mostradas em células epiteliais brônquicas para Alexa Fluor 594 (l); de coelho anti-rato TRITC (n) e anti-cabra Donkey FITC (p). Bar = 20Hm.
Figura 6 células epiteliais brônquicas humanas cultivadas em transwells. Células ciliadas são cultivadas em membranas permeáveis de poliéster (6,5 mm de diâmetro) com uma densidade de semeadura de 50.000 cells por bem (a) Bar = 100μm. Imunomarcação das células cultivadas em transwells com citoqueratina-FITC (verde) e DAPI (azul) demonstra que essas células são células epiteliais, principalmente, Bar = 20Hm. As células são cultivadas em meios submersos por 10 dias, a mídia então alimentado a partir do fundo apenas para mais de 4-6 semanas para criar um ALI até cílios são cultivadas como mostrado em (b) 160x, de ampliação. Veja Suplemento 2 vídeos de batimento dos cílios. (C) TEM imagens demonstram o crescimento dos cílios das culturas ALI em 6 semanas, ampliação = 150000x.
Figura 7 Exemplo de células que devem ser descartados com base na morfologia. Estas células geralmente aparecem quando o tecido foi transplantado muitas vezes. Note-se que ambas as células e de transplante deve ser descartada. a) As células foram coletadas de uma placa com os transplantes que foram cultivadas 6 vezes e banhado em um frasco T75. Dentro de uma semana as células apresentaram morfologia distinta dos que não representam a aparência de pedra de células epiteliais. Em vez disso, finas células alongadas estavam crescendo densamente. b) Mais exemplos de células que não devem ser misturadas com as células epiteliais típicas, mas deve ser descartada. Bar = 100μm.
Tabela 1: Características dos direitos humanos brônquica culturas de células epiteliais
| Taxa de sucesso (# de tecidos) | 09/08 (88,8%) |
| Tempo médio (intervalo) para P1 (semanas) | 4 (3-5) |
| Média (EPM) no celular. em P1 | 15,1 (2,75) x 10 6 |
| Média (EPM) viabilidade na P1 | 99% (2%) |
| (P1 = primeira passagem) | |
Suplemento 1 mostra uma faixa de ciliadas e não ciliadas células epiteliais brônquicas escovado de um segmento brônquicas humanas utilizadas para transplantes, 320X ampliação. Clique Aqui para o vídeo Suplemento 1.
Suplemento 2 Diferenciados células epiteliais brônquicas cresceu em uma interface ar-líquido. Vídeos (2a e 2b) mostram o batimento dos cílios, ampliação de 160X e 320X, respectivamente. Clique Aqui para o vídeo 2A suplemento. Clique Aqui para o vídeo 2B Suplemento.
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Discussion
Neste estudo nós apresentamos métodos detalhados para a cultura e expansão do ensino primário células epiteliais brônquicas humanas. Demonstramos como explantes e transplantes de tecido dos brônquios, cultivados nos meios de comunicação que promovem o crescimento de células epiteliais, pode fornecer uma fonte contínua de células epiteliais das vias aéreas humanas para estudos de modelos não-diferenciada de células (submersa) e diferenciados (cultivadas em ar-líquido interface) . Estas células podem ser utilizadas em sistemas de teste de droga que mais se assemelham a células em seus ambientes reais fisiológico. É muito importante que você assista as células que crescem a partir de explantes / transplantes e confirmar a morfologia de paralelepípedos. Se as células mostram uma morfologia diferente, descartar ambas as células e explantes / transplantes, e continuar o transplante de tecidos sucesso apenas. As culturas ALI em nossas mãos levou mais tempo a ser estabelecido que o relatado anteriormente 2. É possível que a mudança da mídia todos os dias sobre o ALI pode promover mais rapidamente a diferenciação de células epiteliais e no crescimento dos cílios.
Esperamos que os métodos descritos aqui vai encorajá-lo à cultura células epiteliais brônquicas humanas a partir de explantes e usar essas células em seus sistemas de estudo. Afinal, humana baseada em células são necessários estudos para determinar importantes vias de mecanismos de doenças humanas de pulmão e para o desenvolvimento de células in vitro baseado toxicidade e eficácia de triagem para as células humanas levando a avaliação precoce e melhores taxas de sucesso de novos medicamentos.
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Acknowledgments
Os autores são muito gratos ao Dr. Richard Inculet para fornecer os tecidos bronquiais. Aprovações Conselho de Ética em Pesquisa foram obtidos a partir Saúde de São José Hamilton e The University of Western Ontario / London Health Sciences Centre (Dr. David McCormack), Comitê de Tecidos e Arquivos, Departamento de Patologia. Agradecemos também a Ernie Spitzer (Electron Microscopy, McMaster University) para a prestação de TEMs das culturas de nosso ALI, e Farkas Daniela para fornecer alguns dos materiais necessários para a imunocoloração. Este trabalho foi financiado por uma doação de termo Bloco da Sociedade Torácica Ontário; Dr. Asma Yaghi foi apoiado por uma bolsa FSORC, Saúde São José, Hamilton, Ontário, Canadá.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma-Aldrich | A4919 | Use for coating solution |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C8919 | Use for coating solution |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Use for coating solution |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma-Aldrich | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8412 | BSA |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma-Aldrich | P1476 | BPE |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | EGF |
| (±)-Epinephrine | Sigma-Aldrich | E1635 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Tranferrin Human | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | PBS |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | ||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | |
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma-Aldrich | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma-Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Use 1:100 dilution | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence duringprolonged storage |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage |
| H–chst Stain solution | Sigma-Aldrich | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers. |
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References
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts - Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. van Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 1-23 (1992).
- Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 181-196 (1992).
