Corantes FM tem sido de inestimável ajuda na compreensão da dinâmica sináptica. FMs são normalmente seguidos sob o microscópio de fluorescência em condições de estimulação diferente. No entanto, fotoconversão de corantes FM combinado com microscopia eletrônica permite a visualização de distintas piscinas das vesículas sinápticas, entre outros componentes ultra-estrutura, em boutons sináptica.
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Artigo de método
Estudando Pools vesículas Synaptic usando fotoconversão de Corantes Styryl
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fusão das vesículas sinápticas com a membrana plasmática (exocitose) é uma etapa necessária na liberação de neurotransmissores e comunicação neuronal. As vesículas são então recuperados da membrana plasmática (endocitose) e agrupados com o grupo geral de vesículas dentro do terminal nervoso, até que se submetem a um exo-e novo ciclo de endocitose (reciclagem das vesículas). Esses processos têm sido estudados usando uma variedade de técnicas como microscopia eletrônica, gravações de eletrofisiologia, amperometria e medições de capacitância. Importante, durante as últimas duas décadas uma série de marcadores fluorescente etiquetado surgiram, permitindo que técnicas ópticas para acompanhar vesículas na dinâmica a sua reciclagem. Um dos marcadores mais comumente utilizado é o styryl ou FM corante 1; estruturalmente, todos os corantes FM conter uma cabeça hidrofílica e uma cauda lipofílica conectados através de um anel aromático e um ou mais duplas ligações (Figura 1B). Uma experiência clássica corante FM para rotular um conjunto de vesículas consiste em banhar a preparação (Fig. 1Ai) com o corante durante a estimulação do nervo (eletricamente ou com alto K +). Isto induz a reciclagem vesícula eo carregamento posterior do corante em vesículas recentemente endocytosed (Fig. 1A i-iii). Depois de carregar as vesículas com corante, uma segunda rodada de estímulo em um banho de tintura livre provocaria a liberação FM através de exocitose (Figura 1A iv-v), processo que pode ser seguido através do monitoramento da diminuição da intensidade de fluorescência (descoloração).
Embora as tinturas FM têm contribuído grandemente para o campo da reciclagem de vesícula, não é possível determinar a localização exata ou morfologia das vesículas individuais por meio de microscopia de fluorescência convencional. Por essa razão, vamos explicar aqui como FM corantes também podem ser usados como marcadores endocítica meio de microscopia eletrônica, através fotoconversão. A técnica fotoconversão explora a propriedade de corantes fluorescentes para gerar espécies reativas de oxigênio sob iluminação intensa. Preparações fluorescente etiquetado estão submersos em uma solução contendo diaminobenzidina (DAB) e iluminado. Espécies reativas geradas pelo moléculas de corante oxidar o DAB, que forma um precipitado estável e insolúveis que tem uma aparência escura e pode ser facilmente distinguido em microscopia eletrônica 2,3. Como DAB é apenas oxidado nas imediações de moléculas fluorescentes (como as espécies reativas de oxigênio são de curta duração), a técnica garante que as estruturas só fluorescente etiquetado estão indo para conter o precipitado elétron-denso. A técnica permite, assim, o estudo da localização exata e morfologia ativamente reciclagem organelas.
Protocolo
1) Elaboração de Drosophila melanogaster junção neuronal muscular (MNJ)
- Prepare padrão Drosophila salina (130 mM NaCl, 36 mM de sacarose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4.
- Dissecar a preparação em solução salina (1,1). As larvas Drosophila é pined dorsal lateral-up em um prato Sylgard; o lado dorsal é seccionado longitudinal, e os órgãos internos são removidos. A preparação é então esticada e pined. Vários músculos ventral pode ser então utilizado.
2 Stimulation) e coloração FM
- É aconselhável fazer todas as etapas a seguir em condições ....
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Discussão
A poucos passos críticos devem ser levados em conta:
- A incubação DAB deve ser realizada somente após a lavagem completa e extinção dos preparativos. Caso contrário, o glutaraldeído não reagiu irá interagir com DAB e causar a sua precipitação (tipicamente na forma de cristais de plano, que não são elétron denso). Preparações em que essa precipitação ocorre abundantemente raramente são utilizáveis para microscopia eletrônica.
- Vezes a iluminação deve ser otimizada, por meio de testes várias prepara.......
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Resina Epon | Plano GmbH | R1030 | |
| Cloridrato de diaminobenzidina | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Glutaraldeído 50% | AppliChem | A3166 | grau EM |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objetiva 20x 0,5 NA | Olympus Corporation | Objetiva seca | |
| Lâmpada de Hg 100 W | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Soquete da lâmpada com espelho traseiro | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| Câmera MRm | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Aquisição de imagem |
| Filtro de excitação (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dicroico (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Filtro de emissão (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| ME | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
Referências
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog mo....
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Reimpressões e permissões
