Summary
Corantes FM tem sido de inestimável ajuda na compreensão da dinâmica sináptica. FMs são normalmente seguidos sob o microscópio de fluorescência em condições de estimulação diferente. No entanto, fotoconversão de corantes FM combinado com microscopia eletrônica permite a visualização de distintas piscinas das vesículas sinápticas, entre outros componentes ultra-estrutura, em boutons sináptica.
Abstract
A fusão das vesículas sinápticas com a membrana plasmática (exocitose) é uma etapa necessária na liberação de neurotransmissores e comunicação neuronal. As vesículas são então recuperados da membrana plasmática (endocitose) e agrupados com o grupo geral de vesículas dentro do terminal nervoso, até que se submetem a um exo-e novo ciclo de endocitose (reciclagem das vesículas). Esses processos têm sido estudados usando uma variedade de técnicas como microscopia eletrônica, gravações de eletrofisiologia, amperometria e medições de capacitância. Importante, durante as últimas duas décadas uma série de marcadores fluorescente etiquetado surgiram, permitindo que técnicas ópticas para acompanhar vesículas na dinâmica a sua reciclagem. Um dos marcadores mais comumente utilizado é o styryl ou FM corante 1; estruturalmente, todos os corantes FM conter uma cabeça hidrofílica e uma cauda lipofílica conectados através de um anel aromático e um ou mais duplas ligações (Figura 1B). Uma experiência clássica corante FM para rotular um conjunto de vesículas consiste em banhar a preparação (Fig. 1Ai) com o corante durante a estimulação do nervo (eletricamente ou com alto K +). Isto induz a reciclagem vesícula eo carregamento posterior do corante em vesículas recentemente endocytosed (Fig. 1A i-iii). Depois de carregar as vesículas com corante, uma segunda rodada de estímulo em um banho de tintura livre provocaria a liberação FM através de exocitose (Figura 1A iv-v), processo que pode ser seguido através do monitoramento da diminuição da intensidade de fluorescência (descoloração).
Embora as tinturas FM têm contribuído grandemente para o campo da reciclagem de vesícula, não é possível determinar a localização exata ou morfologia das vesículas individuais por meio de microscopia de fluorescência convencional. Por essa razão, vamos explicar aqui como FM corantes também podem ser usados como marcadores endocítica meio de microscopia eletrônica, através fotoconversão. A técnica fotoconversão explora a propriedade de corantes fluorescentes para gerar espécies reativas de oxigênio sob iluminação intensa. Preparações fluorescente etiquetado estão submersos em uma solução contendo diaminobenzidina (DAB) e iluminado. Espécies reativas geradas pelo moléculas de corante oxidar o DAB, que forma um precipitado estável e insolúveis que tem uma aparência escura e pode ser facilmente distinguido em microscopia eletrônica 2,3. Como DAB é apenas oxidado nas imediações de moléculas fluorescentes (como as espécies reativas de oxigênio são de curta duração), a técnica garante que as estruturas só fluorescente etiquetado estão indo para conter o precipitado elétron-denso. A técnica permite, assim, o estudo da localização exata e morfologia ativamente reciclagem organelas.
Protocol
1) Elaboração de Drosophila melanogaster junção neuronal muscular (MNJ)
- Prepare padrão Drosophila salina (130 mM NaCl, 36 mM de sacarose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4.
- Dissecar a preparação em solução salina (1,1). As larvas Drosophila é pined dorsal lateral-up em um prato Sylgard; o lado dorsal é seccionado longitudinal, e os órgãos internos são removidos. A preparação é então esticada e pined. Vários músculos ventral pode ser então utilizado.
2 Stimulation) e coloração FM
- É aconselhável fazer todas as etapas a seguir em condições de pouca luz, a fim de proteger corantes FM de branqueamento.
- Para a estimulação química dos nervos, tampão de potássio alta é usado. Prepare Drosophila salina (ver 1.1), contendo 90 mM de KCl e 10 mM de FM1-43 corante. Manter a solução protegido da luz.
- Banho de preparação com o buffer previamente preparado por 1 minuto à temperatura ambiente.
- Lavar com solução salina padrão Drosophila (1.1) para remover a tintura FM1-43 extracelular. Proceder rapidamente à fixação.
3) Fixação
- Banho de preparação com glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato (PBS) por 45 minutos em temperatura ambiente. Para boa preservação das características morfológicas, o glutaraldeído é preferível a paraformaldeído.
- Lavar uma vez com PBS e em seguida, deixar a preparação submerso por 15 minutos em 100 mM de NH 4 Cl. Este passo é feito a fim de saciar os grupos aldeído livre do fixador glutaraldeído restantes.
- Lavar a solução de NH 4 Cl com PBS normal.
4) fotoconversão
- Incubar a preparação MNJ por 30 minutos a 4 ° C em PBS contendo 1,5 mg ml-1 de diaminobenzidina (DAB).
- Posição da amostra sob o microscópio fluorescente. Encontrar e concentrar o sinal fluorescente usando um relativamente baixo ampliação da objetiva de imersão em água (20x 0,5 NA).
- Iluminam a amostra com a intensidade de luz máxima até o corante FM é totalmente branqueada (Figura 1C). Para controlar se fotoconversão ocorreu, é aconselhável verificar na amostra sob a luz de transmissão antes e depois da tintura de branqueamento FM passo. Se fotoconversão ocorre, um precipitado marrom escuro é esperado (Figura 1C). O tempo de iluminação é variável, dependendo da força de iluminação e também sobre a penetração DAB na preparação. Para a maioria das preparações, encontramos vezes a iluminação de aproximadamente 30-45 minutos para ser o ideal quando se usa um objetivo 20x. Períodos mais curtos de iluminação são usadas para objetivos maior ampliação (60x).
- Para iluminação nós preferimos usar uma lâmpada de mercúrio, com uma lâmpada contendo um espelho de volta, que recolhe os feixes espalhados back-luz, e, portanto, aumenta a intensidade total.
5) Processamento de amostra para o EM
- Osmication
- Prepare uma solução com um volume de tetróxido de ósmio em volumes de árvore de água (cerca de 300 mL por amostra). Trabalho utilizando tetróxido de ósmio deve ser feito sob a capa, usando luvas e equipamentos de proteção aye.
- Incubar a preparação da solução de tetróxido de ósmio por 1 hora à temperatura ambiente (Sob o capô).
- Lavar exaustivamente com PBS (4-5 vezes 5 minutos) e de transferência de cada amostra para um frasco de vidro limpo.
- Desidratação
- Prepare soluções separadas contendo 30, 50, 70 90, 95 e 100% de etanol.
- Adicionar 1 ml de etanol 30% para cada amostra por 5 minutos.
- Adicionar 1 ml de etanol 50% para cada amostra por 5 minutos.
- Adicionar 1 ml de etanol 70% para cada amostra por 5 minutos.
- Adicionar 1 ml de etanol 90% para cada amostra por 5 minutos.
- Adicionar 1 ml de etanol a 95% para cada amostra por 5 minutos (3x).
- Adicionar 1 ml de etanol a 100% a cada amostra por 5 minutos (3x).
- Incorporação e posterior processamento
- Misturar 1 volume de resina Epon com um volume de etanol. Adicioná-lo para a preparação sob rotação contínua (04/02 horas).
- Coloque a preparação em Epon 100% em frascos abertos, permitem que o etanol restantes para evaporar (4-6 horas).
- Coloque a preparação em moldes a 60 ° C por 36 horas.
- Eletrônica de processamento de microscopia. Processo de preparação em 50-80 nm seções finas, utilizando procedimentos ultramicrotomy padrão.
- Eletrônica de imagens de microscopia
- A preparação é fotografada usando os procedimentos convencionais EM.
6) Resultados Representante
Os resultados esperados são descritas nas Figuras 1C e 2. A iluminação procedimento resulta na formação de broprecipitar wn DAB, que será visível em ambas as imagens de fluorescência e de transmissão. A primeira ocorrência durante a iluminação é o desaparecimento da fluorescência associada à coloração dye FM. A fluorescência de fundo induzida pelo fixador de aldeídos, em contrapartida, será visível durante todo o experimento. O branqueamento ocorre normalmente em ~ 10-20 minutos após o início da iluminação. Normalmente nenhum produto fotoconversão pode ser observado neste ponto do tempo.
Iluminação deve ser continuado, e depois de ~ 10 minutos os preparativos vai virar uma sombra marrom, devido à acumulação de DAB (Fig 1C iv) Não está claro porque DAB precipitação e FM corante clareamento não ocorrem simultaneamente, é possível que uma relativamente grande quantidade de DAB oxidada precisa acumular antes de agregação e precipitação, e que, portanto, esta reação é mais lenta do que o processo de branqueamento. Nesta fase, no entanto, a preparação não está pronto para o processamento de microscopia eletrônica, como a precipitação DAB é provável incompleta. Nós preferimos esperar mais 5-10 minutos, durante o qual a preparação (terminal nervoso pré-sináptico) assume uma cor castanho-escuro (ou preto), indicativo de conversão completa. A conversão ligeiro de superfície geral da preparação (por exemplo, das fibras musculares em uma junção neuromuscular) podem ser observados nesta fase. Ele está provavelmente relacionado a uma conversão de DAB induzida por autofluorescência (e / ou fixador de fluorescência), e não é prejudicial para o procedimento.
A preparação é então processada para microscopia eletrônica, e deverá ser verificada a presença de escuro (rotulado) vesículas. Como demonstramos antes de 5,6, essas vesículas são muito mais denso do que os não-rotulados queridos, e por isso são facilmente distinguíveis (Figura 2B). Para aumentar a chance de distinguir bem os diferentes tipos de vesículas, sem contraste de reforço pós coloração das seções devem ser realizados (sem acetato de uranila e citrato de chumbo coloração), a coloração de ósmio é suficiente para observar elementos mais celular, e não é tão escuro como precipitar DAB.
Figura 1: corantes FM e usar para fotoconversão. (A) Representar os passos de uma experiência clássica para o carregamento e distaining vesículas usando corante FM sob estímulo. (I) incubar a amostra em FM corante contendo buffer. (Ii) Estimular (eletricamente ou quimicamente) para induzir a fusão das vesículas na presença de FM corante. (Iii) A endocitose subsequence após a estimulação vai carregar algumas vesículas com FM dye ainda presente no tampão extracelular. (Iv) Substituir o corante extracelular FM por lavagem com tampão. (V) A estimulação novo induzir vesículas carregadas para liberar sua tintura FM sobre exocitose. (B) Esquema mostrando a cabeça de ponte, e na cauda do corante FM1-43. (C) Exemplo de um experimento fotoconversão em Drosophila MNJ. (I) Depois de carregar o MNJ com FM1-43, a lavagem externa moléculas de corante e fixação, a fluorescência de um terminal de nervo pode ser observado com um microscópio convencional de epifluorescência (63x). (Ii-iii) Sob iluminação contínua do corante é completamente branqueada. (Iv) Quando a iluminação continua, a cor preta aparece devido à precipitação diaminobenzidina. Barra de escala representa 10 mM.
Figura 2: EM exemplos de amostras photoconverted (A) A imagem mostra um terminal nervoso contendo vesículas sinápticas, mas não deles são photoconverted; isso pode ser causado por não ter iluminação suficiente ou penetração diaminobenzidina pobres no tecido.. (B) bouton Synaptic com vários escuro (cheia) vesículas que passou por fotoconversão FM. (C) Excesso de iluminação resulta em um terminal geral escuros, onde não vesículas ou organelas são distinguíveis. Barras de escala representam 200 nm.
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Discussion
A poucos passos críticos devem ser levados em conta:
- A incubação DAB deve ser realizada somente após a lavagem completa e extinção dos preparativos. Caso contrário, o glutaraldeído não reagiu irá interagir com DAB e causar a sua precipitação (tipicamente na forma de cristais de plano, que não são elétron denso). Preparações em que essa precipitação ocorre abundantemente raramente são utilizáveis para microscopia eletrônica.
- Vezes a iluminação deve ser otimizada, por meio de testes várias preparações idênticas com tempos diferentes de iluminação. Em nossa experiência, a conversão ótima (Figura 2B) é alcançada em uma janela de tempo de cerca de 5 minutos (por exemplo, entre 35 e 40 minutos após o início da iluminação). Iluminação insuficiente (Figura 2A) é caracterizada por uma falta de organelas rotulados e / ou organelas parcialmente identificados (tais como vesículas que aparecem para conter DAB em apenas metade do seu volume). Iluminação muito tempo, em contraste, os resultados em mais de conversão do produto de conversão DAB acumula, distorce as organelas e foge para o citosol (Figura 2C). Os preparativos aparecem como estruturas negra em microscopia eletrônica, com a morfologia observáveis pouco.
Temos usado a técnica em diversas preparações, incluindo junções neuromusculares de Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, peixe-zebra (Danio rerio) e sapo (Rana pipiens e Rana esculenta). Temos também usou a técnica em células cultivadas, incluindo neurônios cultivados e células neuroendócrinas. Também pode ser usado com sucesso em purificada sinapses do cérebro de rato (sinaptossomas). Portanto, esperamos que a técnica a ser utilizável na maior parte dos preparativos que utilizam a captação de membrana vesicular.
A técnica é a técnica mais sensível para data a determinar o posicionamento e morfologia das organelas endocytosed. Era usado para determinar a localização exata de organelas recentemente endocytosed, incluindo piscinas fisiológicas específicas de vesículas 5,6,7,8. Também tem sido utilizada na determinação do número e morfologia das organelas da via reciclagem ver, por exemplo 9,10.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
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