Summary
Colorantes FM han sido de inestimable ayuda en la comprensión de la dinámica sináptica. FM son normalmente seguidos bajo el microscopio de fluorescencia en condiciones de estimulación diferente. Sin embargo, fotoconversión de tintes FM combinada con el microscopio electrónico permite la visualización de los distintos grupos de vesículas sinápticas, entre los componentes de la ultraestructura otra parte, en botones sinápticos.
Abstract
La fusión de las vesículas sinápticas con la membrana plasmática (exocitosis) es un paso necesario en la liberación de neurotransmisores y la comunicación neuronal. Las vesículas se recuperan de la membrana plasmática (endocitosis) y se agruparon junto con el grupo general de vesículas dentro de la terminal nerviosa, hasta que se someten a un nuevo exo-y el ciclo de endocitosis (reciclaje de vesículas). Estos procesos han sido estudiados usando una variedad de técnicas como la microscopía electrónica, las grabaciones de electrofisiología, amperometría y medidas de capacitancia. Es importante destacar que, durante las últimas dos décadas una serie de marcadores marcados con fluorescencia surgido, lo que las técnicas ópticas para rastrear las vesículas en la dinámica de su reciclaje. Uno de los marcadores más comúnmente utilizado es el estirilo o FM tinte 1; estructuralmente, todos los tintes FM contiene una cabeza hidrofílica y una cola lipofílica conectados a través de un anillo aromático y uno o más dobles enlaces (Fig. 1B). Un experimento clásico tinte FM para etiquetar un grupo de vesículas consiste en bañar la preparación (Fig. 1AI) con el colorante durante la estimulación del nervio (eléctrica o con alto contenido de K +). Esto induce reciclaje de vesículas y la posterior carga del medio de contraste en las vesículas recientemente endocitosis (Fig. 1A I-III). Después de cargar las vesículas con el tinte, una segunda ronda de estímulo en un baño de tinte sin que desencadenan la liberación de FM a través de exocitosis (Fig. 1A IV-V), proceso que puede ser seguido por el control de la disminución de la intensidad de fluorescencia (decoloración).
A pesar de los tintes FM han contribuido en gran medida en el campo de reciclaje de vesículas, que no es posible determinar la localización exacta o la morfología de las vesículas individuales mediante microscopía de fluorescencia convencional. Por esa razón, se explica aquí cómo colorantes FM también se puede utilizar como marcadores endocítica mediante microscopía electrónica, a través de fotoconversión. La técnica fotoconversión explota la propiedad de los tintes fluorescentes para generar especies reactivas de oxígeno en condiciones de iluminación intensa. Preparativos marcados con fluorescencia se sumergen en una solución que contiene diaminobencidina (DAB) y se ilumina. Las especies reactivas generadas por las moléculas de colorante oxidar el DAB, que forma un precipitado estable, insoluble que tiene un aspecto oscuro y se pueden distinguir fácilmente en el microscopio electrónico de 2,3. Como DAB sólo es oxidado en las inmediaciones de las moléculas fluorescentes (como las especies reactivas de oxígeno son de corta duración), la técnica se asegura de que las estructuras sólo la etiqueta fluorescente va a contener la precipitación de electrones de alta densidad. La técnica permite así que el estudio de la ubicación exacta y la morfología de la forma activa de reciclaje orgánulos.
Protocol
1) Preparación de Drosophila melanogaster muscular unión neuronal (UNM)
- Prepare estándar Drosophila salina (130 mM NaCl, 36 mM de sacarosa, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM de MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4.
- Diseccionar la preparación en solución salina (1,1). Las larvas de Drosophila se consumía dorsal de lado en un plato Sylgard; la cara dorsal es seccionado longitudinal, y los órganos internos son removidos. La preparación se estira y se consumía. Varios músculos ventrales pueden ser entonces utilizados.
2) La estimulación y la tinción de FM
- Es aconsejable hacer todos los pasos siguientes en condiciones de poca luz, con el fin de proteger a los colorantes FM de blanqueo.
- Para la estimulación química de los nervios, el tampón de potasio se utiliza. Prepare Drosophila salina (ver 1.1), que contiene 90 mM de KCl y 10 mM de FM1-43 tinte. Mantener la solución de la luz.
- Baño de la preparación con el buffer preparado previamente durante 1 minuto a temperatura ambiente.
- Lavar con solución salina normal Drosophila (1,1) para eliminar extracelular FM1-43 tinte. Proceder rápidamente a la fijación.
3) fijación
- Baño de la preparación con el 2,5% de glutaraldehído en tampón fosfato salino (PBS) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Para una buena conservación de las características morfológicas, el glutaraldehído es preferible a paraformaldehído.
- Lavar una vez con PBS y luego dejar la preparación sumergidas durante 15 minutos en 100 mM de NH 4 Cl. Este paso se realiza con el fin de calmar los grupos aldehído libre de fijador de glutaraldehído restantes.
- Lavar la solución de NH 4 Cl con normalidad PBS.
4) fotoconversión
- Incubar la preparación NMJ durante 30 minutos a 4 ° C en PBS que contiene 1,5 mg ml-1 de diaminobencidina (DAB).
- Coloque la muestra bajo el microscopio de fluorescencia. Encontrar y enfocar la señal fluorescente con un agua relativamente bajo aumento del objetivo de inmersión (20x 0,5 NA).
- Iluminar la muestra con la intensidad máxima de la lámpara hasta que el colorante FM es totalmente blanqueada (fig. 1C). Para controlar si fotoconversión ha ocurrido, es recomendable comprobar en la muestra objeto de transmisión de la luz antes y después de colorante blanqueo de la FM paso. Si fotoconversión se lleva a cabo, un precipitado de color pardo oscuro que se espera (fig. 1C). El tiempo de iluminación es variable, dependiendo de la fuerza de iluminación y también en la penetración de DAB en la preparación. Para la mayoría de las preparaciones, encontramos momentos de iluminación de ~ 30 a 45 minutos para ser óptimo cuando se utiliza un objetivo de 20x. Períodos más cortos de iluminación se utilizan para los objetivos de mayor aumento (60x).
- Para la iluminación se prefiere usar una lámpara de mercurio, con una lámpara que contiene un espejo de nuevo, que recoge los rayos de luz difundida de vuelta, y por lo tanto aumenta la intensidad total.
5) Procesamiento de la muestra para la EM
- Osmication
- Prepare una solución con un volumen de tetróxido de osmio en el volumen de árboles de agua (aprox. 300 l por ejemplo). Trabajo con tetróxido de osmio se debe hacer bajo el capó, el uso de guantes y equipo de protección aye.
- Incubar la preparación en la solución de tetróxido de osmio durante 1 hora a temperatura ambiente (Bajo el capó).
- Lavar exhaustivamente con PBS (4-5 veces 5 minutos) y la transferencia de cada muestra a un frasco de vidrio limpio.
- Deshidratación
- Preparar las soluciones independientes que contienen 30, 50, 70 90, 95 y 100% de etanol.
- Añadir 1 ml de etanol al 30% para cada muestra durante 5 minutos.
- Añadir 1 ml de etanol al 50% para cada muestra durante 5 minutos.
- Añadir 1 ml de etanol al 70% para cada muestra durante 5 minutos.
- Añadir 1 ml de etanol al 90% para cada muestra durante 5 minutos.
- Añadir 1 ml de etanol al 95% para cada muestra por 5 minutos (repita 3 veces).
- Añadir 1 ml de etanol al 100% a cada muestra por 5 minutos (repita 3 veces).
- Incorporación y posterior procesamiento
- Mezclar 1 volumen de Epon resina con un volumen de etanol. Agregar a la preparación en rotación continua (2-4 horas).
- Colocar la preparación en Epon 100% en los frascos abiertos, permiten que el etanol restante se evapore (4-6 horas).
- Colocar la preparación en moldes a 60 ° C durante 36 horas.
- Procesamiento electrónico de microscopía. Proceso de la preparación de las secciones 50 a 80 nm fina, utilizando procedimientos estándar ultramicrotomía.
- Imágenes de microscopía electrónica de
- La preparación es fotografiado usando los procedimientos convencionales de EM.
6) Los resultados representativos
Los resultados esperados se resumen en las Figuras 1C y 2. El procedimiento da como resultado la iluminación en la formación de brown precipitar DAB, que será visible tanto en la fluorescencia y las imágenes de la transmisión. La primera aparición durante la iluminación es la desaparición de la fluorescencia asociada con la coloración tintes FM. La fluorescencia de fondo inducida por el fijador aldehído, por el contrario, será visible durante todo el experimento. El blanqueo se realiza normalmente en ~ 10-20 minutos después del comienzo de la iluminación. Por lo general no fotoconversión producto se puede observar en este punto del tiempo.
La iluminación debe ser continua, y después de unos 10 minutos los preparativos se convertirá en una sombra marrón debido a la acumulación de DAB (Fig. 1C iv) No está claro por qué la precipitación de DAB y FM tinte de blanqueo no tienen lugar al mismo tiempo, es posible que una proporción relativamente grande cantidad de DAB oxidado necesita acumular antes de la agregación y la precipitación, y que por lo tanto, esta reacción es más lenta que el proceso de blanqueo. En esta etapa, sin embargo, la preparación no está listo para el procesamiento de la microscopía electrónica, como la precipitación de DAB es probable incompleta. Preferimos esperar 5-10 minutos más, durante el cual la preparación (terminal nerviosa presináptica) supone una de color marrón oscuro (o negro) de color, indicativo de una conversión completa. Una conversión ligera de la superficie general de la preparación (por ejemplo, de las fibras musculares en la unión neuromuscular) se puede observar en esta etapa. Es más probable en relación a la conversión de DAB inducida por autofluorescencia (y / o fluorescencia fijador), y no es perjudicial para el procedimiento.
La preparación es procesada para microscopía electrónica, y debe ser inspeccionado para detectar la presencia de la oscuridad (etiquetado) de las vesículas. Como hemos demostrado antes de 5,6, estas vesículas son mucho más denso que los no etiquetados, y por lo tanto fáciles de distinguir (Figura 2B). Para aumentar la posibilidad de distinguir bien los diferentes tipos de vesículas, no por contraste, las manchas después de las secciones se deben realizar (sin acetato de uranilo o manchas citrato de plomo), la tinción de osmio es suficiente para observar los elementos más móviles, y no es tan oscuro como precipitar DAB.
Figura 1: colorantes FM y lo utilizan para fotoconversión. (A) representan los pasos de un experimento clásico para la carga y distaining vesículas utilizando colorante FM en la estimulación. (I) incubar la muestra en FM tinte que contiene tampón. (Ii) Estimular (eléctrica o químicamente) para inducir la fusión de vesículas en presencia de FM tinte. (Iii) La endocitosis subsecuencia después de la estimulación a cargar algunos vesículas con tinte FM sigue presente en la memoria intermedia extracelular. (Iv) sustituir el tinte FM extracelular mediante el lavado con tampón. (V) Un nuevo estímulo induce vesículas cargadas de lanzar su tinte de FM en la exocitosis. (B) Esquema que muestra la cabeza, el puente y la cola del colorante FM1-43. (C) Ejemplo de un experimento fotoconversión en Drosophila NMJ. (I) Después de cargar la UNM con FM1-43, el lavado de las moléculas de colorante y la fijación externa, la fluorescencia de una terminación nerviosa se pueden observar con un microscopio convencional de epifluorescencia (63x). (II-III) bajo iluminación continua el tinte es totalmente blanqueada. (Iv) Cuando la iluminación continua, de color negro aparece debido a la precipitación diaminobencidina. Barra de escala representa 10 micras.
Figura 2: EM ejemplos de las muestras photoconverted (A) La imagen muestra una terminación nerviosa que contiene las vesículas sinápticas, pero no de ellos son photoconverted, lo que podría ser causado por no tener suficiente iluminación o la penetración diaminobencidina pobres en el tejido.. (B) bouton Synaptic con varios oscura (lleno) vesículas que pasó por fotoconversión FM. (C) El exceso de los resultados de la iluminación en una terminal general oscuro, donde no hay vesículas o orgánulos son distinguibles. Las barras de escala representan a 200 nm.
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Discussion
A pocos pasos críticos deben ser tomados en cuenta:
- La incubación DAB debe realizarse sólo después de un lavado profundo y enfriamiento de los preparativos. De lo contrario el glutaraldehído no reaccionado va a interactuar con DAB y provocar su precipitación (por lo general en forma de cristales planos, que no son densos a los electrones). Preparados en los casos esta precipitación se lleva a cabo en abundancia rara vez son útiles para microscopía electrónica.
- Veces la iluminación debe ser optimizado, mediante pruebas de varias preparaciones idénticas con tiempos de iluminación diferente. En nuestra experiencia, la conversión óptima (Figura 2B) se logra en una ventana de tiempo de alrededor de 5 minutos (por ejemplo, entre 35 y 40 minutos después del comienzo de la iluminación). Iluminación insuficiente (Figura 2) se caracteriza por la falta de orgánulos etiquetados, y / u orgánulos parcialmente la etiqueta (por ejemplo, aparecen vesículas que contienen DAB sólo en la mitad de su volumen). Iluminación de largo, por el contrario, los resultados en más de la conversión del producto de conversión de DAB se acumula, distorsiona los orgánulos y se escapa en el citosol (Figura 2C). Los preparativos aparecen como estructuras negro en microscopía electrónica, con una morfología poco observable.
Hemos utilizado la técnica en varias preparaciones, incluyendo las uniones neuromusculares de Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, el pez cebra (Danio rerio) y la rana (Rana pipiens y Rana esculenta). También hemos utilizado la técnica en cultivos de células, incluyendo cultivos de neuronas y células neuroendocrinas. También puede ser utilizado con éxito en purificar las sinapsis del cerebro de rata (sinaptosomas). Por lo tanto, esperamos que la técnica que pueda utilizarse en la mayoría de los preparados que utilizan la absorción de la membrana vesicular.
La técnica es la técnica más sensible a la fecha en la determinación de la posición y la morfología de los orgánulos endocitosis. Se utiliza para determinar la ubicación exacta de los orgánulos recientemente endocitosis, incluyendo piscinas fisiológicas específicas de las vesículas 5,6,7,8. También se ha utilizado para determinar el número y la morfología de los orgánulos de la ruta de reciclaje ver, por ejemplo 9,10.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
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