Summary
وقد الأصباغ وزير الخارجية للمساعدة لا تقدر بثمن في فهم ديناميات متشابك. ويتبع عادة وزراء خارجية تحت المجهر الفلورسنت خلال ظروف مختلفة التحفيز. ومع ذلك ، photoconversion من الأصباغ وزير الخارجية جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني يسمح التصور من حمامات متميزة حويصلة متشابك ، الترآيب الدقيق بين مكونات أخرى ، وحبات متشابك.
Abstract
اندماج الحويصلات متشابك مع غشاء البلازما (إيماس) هو خطوة لازمة في الافراج عن العصبي والاتصالات العصبية. ثم يتم استرداد الحويصلات من غشاء البلازما (الإلتقام) ويتم تجميعها معا مع التجمع العام للحويصلات داخل محطة العصبية ، حتى الخضوع لEXO ودورة جديدة الإلتقام (تدوير الحويصلة). وقد درست هذه العمليات باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات مثل المجهر الإلكتروني والتسجيلات الكهربية وamperometry وقياسات السعة. الأهم من ذلك ، خلال العقدين الماضيين ظهر عدد من علامات fluorescently المسمى ، والسماح لتتبع تقنيات بصرية الحويصلات في الديناميات الخاصة بإعادة التدوير. واحدة من العلامات الأكثر شيوعا هي styryl FM أو صبغة 1 ؛ هيكليا ، وكلها تحتوي على الأصباغ وزير الخارجية رئيس ماء وذيل محبة للدهون متصلا من خلال حلقة العطرية واحد أو أكثر من السندات المزدوجة (الشكل 1B). وصبغ التجربة الكلاسيكية وزير الخارجية لتسمية مجموعة من الحويصلات تتمثل في إعداد الاستحمام (الشكل 1Ai) مع الصبغة خلال تحفيز العصب (كهربائيا أو مع ارتفاع K +). هذا يؤدي الى إعادة تدوير حويصلة وتحميل اللاحقة للصباغة في الحويصلات endocytosed مؤخرا (الشكل 1A I - III). وبعد تحميل الحويصلات مع صباغة ، جولة ثانية من التحفيز في حمام صبغة خالية تؤدي الى الافراج عن وزير الخارجية خلال إيماس (الشكل 1A IV - V) ، والعملية التي يمكن اتباعها من خلال رصد انخفاض كثافة مضان (destaining).
على الرغم من الأصباغ وزير الخارجية قد ساهمت إلى حد كبير في مجال إعادة التدوير الحويصلة ، فإنه ليس من الممكن تحديد الدقيق أو توطين مورفولوجية حويصلات الفردية باستخدام المجهر مضان التقليدية. لهذا السبب ، نحن هنا شرح كيفية FM الأصباغ ويمكن أيضا أن تستخدم كعلامات التقامي باستخدام المجهر الإلكتروني ، من خلال photoconversion. تقنية photoconversion يستغل ممتلكات الأصباغ الفلورية لتوليد أنواع الاكسجين التفاعلية تحت الإضاءة الشديدة. وغرقت الاستعدادات fluorescently المسمى في محلول يحتوي على diaminobenzidine (DAB) ومضيئة. رد الفعل الأنواع التي تم إنشاؤها بواسطة جزيئات صبغة أكسدة DAB ، الذي يشكل مستقرة ، غير قابلة للذوبان تترسب يحتوي على المظهر المظلم الذي يبدو ويمكن تمييزها بسهولة في المجهر الإلكترون 2،3. كما يتأكسد DAB فقط في الجوار المباشر للجزيئات فلوري (كما في أنواع الاكسجين التفاعلية قصيرة الأجل) ، وتقنية تضمن هياكل fluorescently فقط المسمى ذاهبون لاحتواء يعجل الإلكترونات كثيفة. هذه التقنية تسمح بذلك دراسة مورفولوجية والمكان المحدد لإعادة تدوير بنشاط العضيات.
Protocol
1) إعداد مفترق ذبابة الفاكهة السوداء البطن العضلية العصبية (NMJ)
- إعداد معيار ذبابة الفاكهة ملحي (كلوريد الصوديوم 130 ملم ، 36 ملم السكروز ، 5 ملي بوكل ، CaCl 2 مم 2 ، 2 مم MgCl 2 ، 5 ملي Hepes ، ودرجة الحموضة 7.3 4.
- تشريح في إعداد المالحة (1.1). هو يرقات ذبابة الفاكهة موهون الجانب الظهري المتابعة في صحن Sylgard ؛ الجانب الظهري هو مقطوع الطولية ، وتتم إزالة الأجهزة الداخلية. وامتدت بعد ذلك لإعداد وموهون. العضلات البطنية ويمكن استخدام عدة بعد ذلك.
2) تحفيز وتلطيخ FM
- فمن المستحسن للقيام بكل الخطوات التالية في ظروف الإضاءة المنخفضة ، من أجل حماية الأصباغ FM من التبييض.
- لتحفيز الكيميائي للأعصاب ، يستخدم العازلة عالية البوتاسيوم. إعداد ذبابة الفاكهة المالحة (انظر 1.1) تحتوي على 90 ملم و 10 ميكرومتر بوكل من FM1 43 صباغة. يبقي الحل محمية من الضوء.
- حمام إعداد مع العازلة معدة مسبقا لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل مع المياه المالحة القياسية ذبابة الفاكهة (1.1) لإزالة خارج الخلية FM1 - 43 صباغة. المضي قدما بسرعة الى التثبيت.
3) إصلاح
- حمام إعداد غلوتارالدهيد مع 2.5 ٪ في الفوسفات مخزنة (PBS) المالحة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. للحفاظ على ميزات جيدة من الصرفية ، ويفضل أن غلوتارالدهيد بارافورمالدهيد.
- يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ثم تترك إعداد المغمورة لمدة 15 دقيقة في 100 ملم من الكلورين NH 4. تتم هذه الخطوة من أجل إخماد مجموعات ألدهيد خالية من تثبيتي غلوتارالدهيد المتبقية.
- غسل حل NH 4 من الكلورين مع برنامج تلفزيوني عادي.
4) Photoconversion
- احتضان إعداد NMJ لمدة 30 دقيقة عند 4 مئوية في برنامج تلفزيوني تحتوي على 1.5 ملغ مل من diaminobenzidine - 1 (DAB) درجة.
- موقف العينة تحت المجهر الفلورسنت. العثور على وتركيز إشارة الفلورسنت باستخدام المياه التكبير منخفضة نسبيا الهدف الغمر (20X 0.5 NA).
- تسليط الضوء على عينة مع شدة المصباح أقصى حتى يتم صبغ FM ابيض تماما (الشكل 1C). للسيطرة على photoconversion إذا حدث ، من المستحسن أن الاختيار في العينة تحت ضوء انتقال قبل وبعد خطوة صبغ تبيض FM. إذا photoconversion يأخذ مكان ، فمن المتوقع أن يعجل البني الداكن (الشكل 1C). الوقت الإضاءة هو متغير ، وهذا يتوقف على قوة الإضاءة وأيضا على تغلغل DAB في التحضير. بالنسبة لمعظم الأعمال التحضيرية ، وجدنا مرات إضاءة 30-45 دقيقة ~ وكأنه الحل الأمثل عند استخدام هدفا 20X. وتستخدم الإضاءة فترات أقصر لتحقيق أهداف أعلى التكبير (60x).
- الإضاءة لكننا نفضل استخدام مصباح الزئبق ، مع السكن مصباح تحتوي على المرآة الخلفية ، والذي يجمع أشعة الضوء الخلفي متناثر ، وبالتالي يزيد كثافة المجموع.
5) تجهيز العينة للEM
- Osmication
- يعد حل مع مجلد واحد من رباعي أكسيد الأوزميوم في حجم شجرة من الماء (ما يقارب 300 ميكرولتر لكل عينة). رباعي أكسيد الأوزميوم العمل به يجب ان يتم تحت غطاء محرك السيارة ، وذلك باستخدام القفازات ومعدات الحماية ايي.
- احتضان إعداد في حل رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (تحت غطاء محرك السيارة).
- غسل نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني (4-5 مرات 5 دقائق) ونقل العينات إلى كل قارورة زجاجية نظيفة.
- جفاف
- إعداد الحلول منفصلة تحتوي على 30 ، 50 ، 70 90 و 95 و 100 ٪ من الايثانول.
- إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 30 ٪ لكل عينة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 50 ٪ لكل عينة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 1 مل من الايثانول 70 ٪ على كل عينة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 90 ٪ من كل عينة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 1 مل من الايثانول 95 ٪ على كل عينة لمدة 5 دقائق (اكرر 3X).
- إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ لكل عينة لمدة 5 دقائق (اكرر 3X).
- التضمين ومزيد من المعالجة
- 1 مزيج من راتنج EPON حجم مجلد واحد مع من الايثانول. إضافة إلى إعداد إطار التناوب المستمر (2-4 ساعات).
- إعداد مكان في EPON 100 ٪ في قوارير مفتوحة ، والسماح للايثانول المتبقية لتتبخر (4-6 ساعات).
- إعداد مكان في قوالب على 60 درجة مئوية لمدة 36 ساعة.
- الإلكترون المجهري المعالجة. عملية التحضير في القسمين 50-80 نانومتر رقيقة ، وذلك باستخدام إجراءات ultramicrotomy القياسية.
- التصوير المجهري الإلكترون
- والتقط إعداد الإجراءات التقليدية باستخدام EM.
6) الممثل النتائج
وترد النتائج المتوقعة في 1C أرقام و 2. نتائج الإجراء الإضاءة في تشكيل إخوانهسفل يعجل DAB ، والتي سوف تكون مرئية في كل مضان التصوير والبث. التواجد الأول خلال الإضاءة هي اختفاء مضان المرتبطة تلوين صبغ FM. ومضان الخلفية يسببها تثبيتي ألدهيد ، في المقابل ، سوف تكون واضحة في كافة مراحل التجربة. التبييض يحدث عادة في غضون دقائق 10-20 ~ بعد بدء الإضاءة. عادة يمكن أن يلاحظ أي منتج photoconversion في هذه النقطة الزمنية.
وينبغي أن تستمر الإضاءة ، وبعد 10 دقائق ~ الاستعدادات سوف تتحول إلى الظل البني بسبب تراكم DAB (الشكل 1C الرابع) ومن غير الواضح لماذا DAB هطول الأمطار وصبغ FM تبيض لا تأخذ مكان في وقت واحد ، فمن الممكن أن عدد كبير نسبيا تتأكسد كمية DAB يحتاج إلى تجميع وتراكم قبل هطول الأمطار ، وبالتالي رد الفعل هذا هو أبطأ من عملية التبييض. في هذه المرحلة ، ومع ذلك ، وإعداد ليست مستعدة لتجهيز المجهر الإلكتروني ، حيث أن الأمطار DAB غير مكتملة احتمالا. نحن نفضل الانتظار لمدة 5-10 دقائق أطول خلالها التحضير (العصب الطرفي قبل المشبكي) يفترض وجود اللون البني الغامق (أو أسود) اللون ، مما يدل على التحويل الكامل. ويمكن ملاحظة تحول طفيف من سطح العامة لإعداد (على سبيل المثال ، من ألياف العضلات في الموصل العصبي العضلي) في هذه المرحلة. ومن المرجح أنها ذات الصلة لتحويل يسببها DAB التي تألق ذاتي (و / أو مضان تثبيتي) ، وأنها ليست ضارة لهذا الاجراء.
ثم تتم معالجتها في التحضير للالمجهر الإلكتروني ، ويجب أن يتم التحقق من وجود حويصلات (المسمى) الظلام. كما أننا أظهرنا قبل 5،6 ، وهذه الحويصلات هي أكثر كثافة بكثير من تلك غير المسمى ، وبالتالي فهي تمييزها بسهولة (الشكل 2B). لزيادة فرصة جيدة للتمييز أنواع مختلفة من الحويصلات ، ينبغي أن يتم تنفيذ أي تباين تعزيز تلطيخ آخر من المقاطع (لا اليورانيل خلات الرصاص أو التلوين سيترات) ، وتلطيخ الأوزميوم كافية لمراقبة أكثر العناصر الخلوية ، وليس كما الظلام كما يعجل DAB.
الشكل 1 : الأصباغ وزير الخارجية واستخدامها لphotoconversion. (أ) تمثل خطوات تجربة كلاسيكية للتحميل وdistaining الحويصلات باستخدام صبغة FM تحت التحفيز. (ط) احتضان العينة تحتوي على صبغة FM العازلة. (ب) حفز (كهربائيا أو كيميائيا) للحث على الانصهار في الحويصلة جود صبغة FM. (ج) سوف الإلتقام subsequence التحفيز بعد تحميل بعض الحويصلات مع صبغة FM لا تزال موجودة في المنطقة العازلة خارج الخلية. (د) استبدال الصبغة خارج الخلية مع وزير الخارجية عن طريق الغسيل العازلة. (ت) وسوف تحفيز جديدة تحفز حويصلات تحميلها للافراج عن صبغ بها وزير الخارجية على إيماس. (ب) تخطيطي يظهر الرأس والذيل وجسر للصباغة FM1 - 43. (C) مثال لتجربة photoconversion NMJ في ذبابة الفاكهة. (ط) بعد تحميل NMJ مع FM1 - 43 ، وغسل جزيئات الصبغة الخارجية وإصلاح ، ويمكن لاحظت مضان لمحطة عصب مع مجهر epifluorescence التقليدية (63x). (II - III) تحت الإضاءة المستمر هو ابيض تماما الصبغة. (د) عند إضاءة مستمرة ، لونها أسود يبدو بسبب هطول الأمطار diaminobenzidine. شريط الحجم يمثل 10 ميكرومتر.
الشكل 2 : EM أمثلة لعينات photoconverted (أ) صورة تظهر العصبية الطرفية التي تحتوي على حويصلات متشابك ، ولكن ليس منهم من photoconverted ؛ قد يكون سبب ذلك عدم وجود إنارة كافية أو الفقراء diaminobenzidine تغلغل في الأنسجة. (B) حبة متشابك مع عدة حويصلات (مملوءة) المظلمة التي مرت photoconversion FM. (ج) زيادة النتائج محطة إنارة في الظلام an الشاملة حيث لا حويصلات أو العضيات يمكن تمييزها. أشرطة النطاق تمثل 200 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وينبغي اتخاذ بعض الخطوات الهامة في الاعتبار :
- ينبغي أن يقوم على حضانة DAB إلا بعد الغسل الكامل والتبريد من الاستعدادات. وإلا فإن رد فعل غير غلوتارالدهيد التفاعل مع وتسبب هطول الأمطار DAB والخمسين (عادة على شكل بلورات المسطحة ، والتي لا الإلكترون الكثيفة). هذه الاستعدادات حيث هطول الأمطار بغزارة يحدث نادرا ما صالحة للاستعمال المجهر الإلكتروني.
- وينبغي أن يكون الأمثل مرات الإضاءة ، عن طريق اختبار استعدادات مماثلة عدة مرات مع إضاءة مختلفة. في تجربتنا ، ويتحقق التحويل الأمثل (الشكل 2B) في إطار الوقت من حوالي 5 دقائق (على سبيل المثال ، بين 35 و 40 دقيقة بعد بدء الإضاءة). وتتميز الإضاءة غير كافية (الشكل 2A) بسبب عدم وجود العضيات المسمى ، و / أو العضيات المسمى جزئيا (مثل حويصلات تظهر لاحتواء DAB في نصف فقط من حجمها). إضاءة طويلة ، في المقابل ، في تحويل نتائج الإفراط في تحويل المنتج DAB يتراكم ، ويشوه العضيات ويهرب في العصارة الخلوية (الشكل 2C). التحضيرات تظهر هياكل سوداء في المجهر الإلكتروني ، مع التشكل ملاحظتها قليلا.
وقد استخدمنا هذه التقنية في الأعمال التحضيرية عدة ، بما في ذلك الوصلات العصبية والعضلية من ايليجانس انواع معينة ، ذبابة الفاكهة السوداء البطن ، الزرد (دانيو rerio) والضفدع (النابصة رنا ورنا esculenta). وقد استخدمنا هذه التقنية أيضا في الخلايا المستزرعة ، بما فيها الخلايا العصبية والخلايا المستزرعة الهرموني العصبي. ويمكن أيضا أن تستخدم بنجاح في تنقيته من نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ الفئران (synaptosomes). ولذلك ، فإننا نتوقع أن تكون قابلة للاستخدام التقنية لفي معظم الاستعدادات التي تستخدم الحويصلي امتصاص الغشاء.
الأسلوب هو الأسلوب الأكثر حساسية حتى الآن في تحديد المواقع ومورفولوجية العضيات endocytosed. انه كان يستخدم لتحديد الموقع الدقيق للعضيات endocytosed مؤخرا ، بما في ذلك حمامات فسيولوجية معينة من الحويصلات 5،6،7،8. كما تم استخدامه في تحديد عدد والتشكل من العضيات في مسار إعادة التدوير انظر على سبيل المثال 9،10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Science. 303, 2037-2039 (2004).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons. Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).
- Lange, R. P. J. de, de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held. J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).
- Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction. Neuron. 39, 529-541 (2003).
