Summary
هذا البروتوكول يوضح طرق لاستخراج الحيوانات المنوية من الخصيتين للذكور وإناث الفئران ثم تلقيح. هذا الإجراء مفيد عندما يكون في حاجة الى الوقت الدقيق في الدراسات التنموية ، وكذلك العمل المعدلة وراثيا.
Abstract
القوارض من جنس Peromyscus (الغزلان الفئران) هي الأكثر انتشارا في أميركا الشمالية الأصليين الثدييات. وتستخدم الأنواع Peromyscus في طائفة واسعة من البحوث بما في ذلك السموم ، وعلم الأوبئة ، والبيئة ، والسلوكيات ، والدراسات الجينية. هنا أنها توفر نموذجا مفيدا للمظاهرات التلقيح الاصطناعي.
أساليب مماثلة لتلك المعروضة هنا قد سبق استخدامها في العديد من الدراسات الماوس الغزلان ، ولكن تم نشر أي بروتوكول مفصلة. نحن هنا لشرح الطريقة الأساسية التلقيح الاصطناعي. هذا الأسلوب ينطوي على استخراج الخصيتين من القوارض ، ثم عزل الحيوانات المنوية من البربخ والأسهر. توضع الحيوانات المنوية الناضجة ، والآن في خليط الحليب ، في الجهاز التناسلي للإناث في وقت الإباضة. يحسب التسميد ك 0 يوم لتوقيت تطور الجنين. ويمكن بعد ذلك يمكن استرجاع الأجنة عند نقطة في الوقت المطلوب والتلاعب بها.
ويمكن استخدام التلقيح الاصطناعي في مجموعة متنوعة من أنواع القوارض حيث التوقيت الدقيق الجنين أمر بالغ الأهمية أو من الصعب الحصول عليها. هذه التقنية أمر حيوي بالنسبة للأنواع أو سلالات (بما في ذلك معظم Peromyscus) والتي قد لا لم فورا و / أو التزاوج حيث من الصعب تقييم. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر التلقيح الاصطناعي التوقيت الدقيق لتطور الجنين إما التقدم التنموي في رسم الخرائط و / أو العمل المعدلة وراثيا. ويمكن أن يستخدم هذا الرقم انخفض من الحيوانات منذ مكفولة الإخصاب. وقد كان هذا الأسلوب حيوية لتعزيز نظام Peromyscus ، والمؤمل ان تعود بالنفع الآخرين كذلك.
Protocol
التلقيح الاصطناعي
يستخدم التلقيح الاصطناعي بدلا من التزاوج الطبيعي لزيادة فرص أن جميع الإناث سوف تصبح حاملا. وقد استخدم 2 من الذكور مقابل كل 1 superovulated الإناث أو الإناث من المعروف أن في ودقي. وضعت epididymides من أذناب الفئران الذكور الناضجة في تعليق الحليب 9 ٪ ، وبقرت مع الإبر قياس 18. ولم يسمح للحيوانات المنوية تسبح بحرية لبضع دقائق ثم أخذ epididymides من الخليط. تم تقييم نظام التعليق مع المجهر لالتقاء الحيوانات المنوية ومتحركة. كليلة وقياس 22 1 ½ كان يستخدم إبرة طويلة بوصة لإدارة الحيوانات المنوية. وكان يوضع ينحني 120 درجة حوالي 3 / 4 ال نزولا الإبرة. تم إدراج إبرة في المهبل حتى ينحني و0،025 -- 0.05mls حقن. إذا تم استخدام مساعدا لعقد الإناث في الموقف المناسب ، ليست هناك حاجة لاستخدام مواد التخدير.
إعداد
- استخدام لمدة 6 4 ذكور إناث
- الموت ببطء ذكور في الحظيرة
- إعداد حوالي 5 مل من الحليب 9 ٪ من الحليب المجفف
- وضع 1.5 مل في طبق بتري الصغيرة
- تخلص من epididymus والأسهر
- وضعت في 1.5ml من الحليب 9 ٪
- باستخدام اثنين من الإبر قياس 18 ، والحركة باستخدام قطع طويلة مع الإبر ، وشريحة وفتح epididymus الأسهر للافراج عن الحيوانات المنوية
- إخراج خلفها الأنسجة والتحقق من الحيوانات المنوية تحت المجهر
حقن
- استخدام إبرة حادة في زاوية 120 درجة
- عقد الماوس في اليد وحقن الخليط. إذا كان غير مريح مع شخص واحد وإجراء الحقن ، ويمكن استخدام شخصين. ينبغي عدم استخدام أي مخدر ، وعلى واحد يعرف كيف يمكن أن تؤثر على هذا الإجراء.
- 0.05ml استخدام الحيوانات المنوية / مزيج الحليب لكل أنثى
المستلم الإناث
- لا اللطاخة المهبلية على الإناث المستلم (قبل هذا الوقت من الإناث المتلقي يجب أن تكون في مقدمات الوداق / شبق)
- وينبغي أن الإناث التي لم تكن قد وصلت يوم 5 شبق التي ربما لم تستخدم
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأود أن أشكر مايك ديوي من مركز ألبوم الوراثية Peromyscus بصيرته عن القيمة ، والصبر ، والمعرفة على التكاثر القوارض.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-772-30 | |
| 18 G needle | Tool | BD Biosciences | 305195 | |
| Powdered milk | Reagent | Any Supplier | ||
| 1 mL syringe | Tool | National Scientific Company | S7510-1 | |
| Forceps | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14200-075 | |
| 22 G blunt needle | Tool | Give to me |
