Summary
Этот протокол демонстрирует методы для извлечения сперматозоидов из яичек самцов, а затем inseminating самок мышей. Эта процедура полезна, когда точное время необходимо в развитии исследований, а также трансгенные работы.
Abstract
Грызуны Реготузсиз рода (олени мышей) являются наиболее распространенными коренных народов Северной Америки млекопитающих. Реготузсиз видов используются в широком диапазоне исследований, включая токсикологии, эпидемиологии, экологии, поведенческие и генетические исследования. Здесь они предоставляют полезную модель для демонстрации искусственного оплодотворения.
Методы, аналогичные отображаются здесь ранее использовались в нескольких исследованиях, мышь оленя, но не подробный протокол был опубликован. Здесь мы показываем, основным методом искусственного оплодотворения. Этот метод влечет за собой извлечение из яички грызунов, то выделение спермы из придатка яичка и семявыносящих протоков. Зрелые сперматозоиды, теперь в молочную смесь, помещаются в половые пути самки в момент овуляции. Оплодотворение считается как день 0 для синхронизации развития эмбриона. Эмбрионы могут быть получены в заданное время точкой и манипулировать.
Искусственное оплодотворение может быть использован в различных видов грызунов, где точные сроки эмбрион имеет решающее значение или трудно получить. Эта техника имеет жизненно важное значение для видов или штаммов (в том числе большинство Реготузсиз), которые не могут спариваться сразу и / или там, где спаривание трудно оценить. Кроме того, искусственное осеменение обеспечивает точное время для развития эмбриона или в отображении развития прогресса и / или трансгенных работы. Сокращение числа животных может быть использован с оплодотворением гарантируется. Этот метод имеет жизненно важное значение для дальнейшего Реготузсиз системы, и мы надеемся принести пользу другим, а также.
Protocol
Искусственное оплодотворение
Искусственное оплодотворение используется вместо природного вязки, чтобы увеличить шансы, что все женщины имеют станет беременной. 2 мужчины была использована на каждый 1 superovulated женщин или женщин, как известно, в эстрального. Caudae epididymides из зрелых самцов мышей были помещены в 9%, молока подвески и нарезанный открытым с 18 иглами калибра. Спермы было разрешено свободно плавать в течение нескольких минут, а затем epididymides были взяты из смеси. Подвески оценивали с помощью микроскопа для слияния и подвижных сперматозоидов. Тупой 22 калибра 1 ½ дюйма длиной иглы, используемые для введения спермы. 120 ° изгиб был сделан около 3 / 4-й путь вниз иглу. Игла вводится во влагалище до изгиба и 0,025 - 0.05mls вводили. Если помощник используется для хранения женщиной в соответствующем положении, использование анестезии не требуется.
Подготовка
- Используйте 4 мужчин в течение 6 женщин
- Эвтаназии мужчин в виварий
- Подготовка около 5 мл 9% молока из сухого молока
- Положите 1,5 мл в небольших чашках Петри
- Вырежьте придаток яичника и семявыносящих протоков
- Положить в 1,5 мл 9% молока
- С помощью двух игл 18 калибр, и с помощью длинных резки движения с иглы, кусочек открытым придаток яичника и семявыносящих протоков выпустить сперму
- Выньте оставшиеся ткани и проверить его на сперму под микроскопом
Инъекция
- Используйте тупой иглой на 120 градусов
- Держите мышь в руки и вводят смесь. Если неудобно с одним лицом, занимающим и инъекционных, два человека могут быть использованы. Нет анестезии должны быть использованы, как на один знает, как это может повлиять на процедуру.
- Используйте 0.05ml спермы / молоко смеси на женский
Получатель женщин
- У вагинальных мазков на получателя женщин (к этому времени получателя женщины должны быть в проэструсе / течки)
- Женщины, которые не достигли течки по 5-й день, вероятно, не использовались
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Я хотел бы поблагодарить Майка Дьюи из Реготузсиз Генетический центр Биржевые котировки за ценную информацию, терпения и знаний о грызунах воспроизводства.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-772-30 | |
| 18 G needle | Tool | BD Biosciences | 305195 | |
| Powdered milk | Reagent | Any Supplier | ||
| 1 mL syringe | Tool | National Scientific Company | S7510-1 | |
| Forceps | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14200-075 | |
| 22 G blunt needle | Tool | Give to me |
