Summary
Ce protocole illustre des méthodes pour extraire le sperme des testicules des mâles et ensuite inséminer les souris femelles. Cette procédure est utile lorsque l'heure précise est nécessaire dans les études de développement ainsi que les travaux transgéniques.
Abstract
Les rongeurs de l'Peromyscus genre (souris sylvestre) sont les plus répandus natif mammifères nord-américain. Peromyscus espèces sont utilisées dans un large éventail de recherche, y compris la toxicologie, l'épidémiologie, l'écologie, du comportement, et les études génétiques. Ici, ils fournissent un modèle utile pour les démonstrations de l'insémination artificielle.
Des méthodes similaires à celles affichées ici ont déjà été utilisées dans plusieurs études de souris sylvestres, mais aucun protocole détaillé a été publié. Ici nous démontrons la méthode de base de l'insémination artificielle. Cette méthode consiste à extraire les testicules du rongeur, puis à isoler les spermatozoïdes de l'épididyme et le canal déférent. Les spermatozoïdes matures, maintenant dans un mélange de lait, sont placés dans l'appareil génital de la femelle au moment de l'ovulation. La fertilisation est compté comme 0 jours pour la synchronisation du développement embryonnaire. Les embryons peuvent alors être récupérées au moment du point désiré et manipulés.
L'insémination artificielle peut être utilisé dans une variété d'espèces de rongeurs, où le calendrier exact est cruciale embryon ou difficiles à obtenir. Cette technique est vitale pour les espèces ou souches (y compris les plus Peromyscus) qui ne peut s'accouplent immédiatement et / ou lorsque l'accouplement est difficile à évaluer. En outre, l'insémination artificielle permet timing exact pour le développement de l'embryon, soit dans la cartographie des progrès de développement et / ou travaux transgéniques. Réduction du nombre d'animaux peut être utilisé depuis la fécondation est garanti. Cette méthode a été essentielle à la poursuite du système Peromyscus, et nous espérons bénéficier d'autres aussi.
Protocol
Insémination Artificielle
L'insémination artificielle est utilisée à la place d'accouplements naturels pour augmenter les chances que toutes les femelles ont deviennent enceintes. 2 mâles a été utilisé pour chaque 1 femelles superovulées ou une femelle connue pour être en oestrus. Les épididymes caudae de souris mâles matures ont été placés dans une suspension de lait de 9% et tranchées ouvertes avec 18 aiguilles de calibre. Le sperme a été autorisée à nager librement pendant quelques minutes puis les épididymes ont été prises à partir du mélange. La suspension a été évaluée avec un microscope pour confluence et les spermatozoïdes mobiles. Un émoussée de calibre 22 de 1 ½ pouce de long aiguille a été utilisée pour administrer le sperme. Un virage à 120 ° a été placé environ 3 / 4 ème de la descente de l'aiguille. L'aiguille a été insérée dans le vagin jusqu'à la courbure et 0,025 - 0.05mls injecté. Si un assistant est utilisé pour maintenir les femmes dans la position appropriée, l'utilisation d'anesthésiques n'est pas nécessaire.
Préparation
- Utilisez 4 mâles pour 6 femelles
- Euthanasier les mâles à le vivarium
- Préparer environ 5 ml de lait de 9% par du lait en poudre
- Mettez 1,5 ml en boîte de Petri petits
- Découpez l'épididyme et le canal déférent
- Mettre en 1.5ml de lait 9%
- L'utilisation de deux aiguilles de calibre 18, et en utilisant de longues mouvement de coupe avec des aiguilles, tranche ouverte l'épididyme et le canal déférent de libérer le sperme
- Prenez à gauche en sortant sur un tissu et vérifier les spermatozoïdes sous le microscope
Injection
- Utilisez une aiguille émoussée à 120 ° d'angle
- Maintenez la souris dans la main et injecter le mélange. Si à l'aise avec une personne qui détient et l'injection, deux personnes peuvent être utilisées. Pas d'anesthésie devrait être utilisée, comme le sait comment cela pourrait influer sur la procédure.
- Utiliser 0,05 ml de sperme / mélanger le lait par femelle
Femelles receveuses
- Ne le frottis vaginal des femelles receveuses (à cette époque l'femelles receveuses doivent être en proestrus / œstrus)
- Les femelles qui n'ont pas atteint l'oestrus par Jour 5 ne devrait probablement pas utilisés
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Acknowledgments
Je tiens à remercier Mike Dewey partir du Centre de stock génétique Peromyscus pour ses précieux renseignements, la patience et de connaissances sur la reproduction chez les rongeurs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-772-30 | |
| 18 G needle | Tool | BD Biosciences | 305195 | |
| Powdered milk | Reagent | Any Supplier | ||
| 1 mL syringe | Tool | National Scientific Company | S7510-1 | |
| Forceps | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14200-075 | |
| 22 G blunt needle | Tool | Give to me |
