Summary
Questo protocollo vengono utilizzati dei metodi per l'estrazione degli spermatozoi dai testicoli dei maschi e poi inseminazione topi femmina. Questa procedura è utile quando il tempo preciso è necessaria in studi sullo sviluppo e il lavoro transgenici.
Abstract
Roditori del genere Peromyscus (topi cervi) sono i mammiferi autoctoni più diffusi del Nord America. Specie Peromyscus sono utilizzati in una vasta gamma di ricerca tra cui tossicologia, epidemiologia, ecologia, comportamento, e gli studi genetici. Qui essi forniscono un utile modello per le dimostrazioni di inseminazione artificiale.
Metodi simili a quelli visualizzati qui sono già state utilizzate in diversi studi topo cervo, ancora nessun protocollo dettagliato è stato pubblicato. Qui mostriamo il metodo di base della fecondazione artificiale. Questo metodo comporta l'estrazione dei testicoli dal roditore, poi isolare gli spermatozoi dall'epididimo e vasi deferenti. Lo sperma maturo, ora in una miscela di latte, sono collocati nel tratto riproduttivo della femmina al momento della ovulazione. Fecondazione viene considerato come 0 giorni per tempi di sviluppo embrionale. Gli embrioni possono poi essere recuperate al momento desiderato-point e manipolata.
L'inseminazione artificiale può essere utilizzato in una varietà di specie di roditori in cui tempistica esatta embrione è fondamentale o difficile da ottenere. Questa tecnica è di vitale importanza per le specie o ceppi (tra cui la maggior Peromyscus) che non possono accoppiarsi immediatamente e / o dove l'accoppiamento è difficile da valutare. Inoltre, l'inseminazione artificiale provvede esatta tempistica per lo sviluppo embrionale sia in corso la mappatura dello sviluppo e / o di lavoro transgenici. Riduzione del numero di animali possono essere utilizzati in quanto la fecondazione è garantita. Questo metodo è stato fondamentale per promuovere il sistema Peromyscus, e si spera beneficiare gli altri.
Protocol
Inseminazione artificiale
L'inseminazione artificiale è usato al posto di accoppiamenti naturali per aumentare le probabilità che tutte le femmine hanno avrà una gravidanza. 2 maschi è stato utilizzato per ogni 1 femmine superovulated o una femmina noti per essere in estro. L'epididimo caudae da maturare topi maschi sono stati collocati in una sospensione di latte 9% e affettato aperto con 18 aghi di calibro. Lo sperma è stato permesso di nuotare liberamente per qualche minuto e poi il epididimi sono state prese dalla miscela. La sospensione è stata valutata con un microscopio per la confluenza e di spermatozoi mobili. Un brusco AWG 22 ago 1 ½ pollice di lunghezza è stato utilizzato per amministrare lo sperma. A 120 piegare ° era collocato circa 3 / 4 ° verso il basso l'ago. L'ago è stato inserito nella vagina fino alla curva e 0,025 - 0.05mls iniettato. Se un assistente è utilizzato per contenere la femmina nella posizione appropriata, l'uso di anestetici non è necessario.
Preparazione
- Utilizzare 4 maschi per 6 femmine
- Euthanize maschi al vivaio
- Preparare circa 5 ml di latte 9% di latte in polvere
- Mettere 1,5 ml in piccole piastre di Petri
- Tagliare dell'Epididymus e vasi deferenti
- Metti in 1,5 ml del 9% latte
- Usando due aghi calibro 18, e con lunghi movimenti di taglio con aghi, fetta aperto dell'Epididymus e deferenti per rilasciare gli spermatozoi
- Estrarre rimasto tessuti e verificare la presenza di spermatozoi al microscopio
Iniezione
- Utilizzare l'ago smussato a 120 ° angolo
- Tenete il mouse in mano e iniettare miscela. Se a disagio con una persona in possesso e l'iniezione, due persone possono essere utilizzati. Nessun anestetico dovrebbe essere utilizzato, come si sa su come questo potrebbe influenzare la procedura.
- Utilizzare 0,05 ml di sperma / latte mix per femmina
Destinatario femmine
- Fare striscio vaginale sulle femmine destinatario (in questo periodo le femmine destinatario deve essere in proestro / estro)
- Femmine che non hanno raggiunto estro da 5 ° giorno non dovrebbe probabilmente utilizzato
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Acknowledgments
Vorrei ringraziare Mike Dewey dal Centro Peromyscus patrimonio genetico per le sue informazioni preziose, la pazienza e la conoscenza sulla riproduzione dei roditori.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-772-30 | |
| 18 G needle | Tool | BD Biosciences | 305195 | |
| Powdered milk | Reagent | Any Supplier | ||
| 1 mL syringe | Tool | National Scientific Company | S7510-1 | |
| Forceps | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14200-075 | |
| 22 G blunt needle | Tool | Give to me |
