Summary
Este protocolo muestra los métodos para la extracción de los espermatozoides desde los testículos de los machos y luego inseminar a las hembras. Este procedimiento es útil cuando el tiempo exacto que se necesita en los estudios de desarrollo, así como el trabajo transgénico.
Abstract
Los roedores del género Peromyscus (ratón venado) son los mamíferos nativos más prevalente en América del Norte. Peromyscus especies se utilizan en una amplia gama de investigación, incluyendo la toxicología, la epidemiología, la ecología, comportamiento, y los estudios genéticos. Aquí un modelo útil para las manifestaciones de la inseminación artificial.
Métodos similares a los que se muestran aquí se han utilizado previamente en varios estudios el ratón venado, todavía no existe un protocolo detallado se ha publicado. Aquí se demuestra el método básico de la inseminación artificial. Este método consiste en la extracción de los testículos de los roedores, y luego aislar los espermatozoides del epidídimo y conducto deferente. El esperma maduro, ahora en una mezcla de leche, se colocan en el tracto reproductivo de la hembra en el momento de la ovulación. La fertilización se cuenta como el día 0 para el tiempo de desarrollo del embrión. Los embriones se pueden recuperar en el tiempo deseado de puntos y manipulado.
La inseminación artificial se puede utilizar en una variedad de especies de roedores en el momento exacto de embriones es crucial y difícil de obtener. Esta técnica es de vital importancia para las especies o cepas (incluyendo la mayoría de Peromyscus) que no pueden aparearse inmediatamente y / o donde el apareamiento es difícil de evaluar. Además, la inseminación artificial proporciona tiempo exacto para el desarrollo del embrión ya sea en la cartografía de progreso en el desarrollo y / o trabajo transgénico. Reducción del número de animales se pueden utilizar desde la fecundación está garantizada. Este método ha sido vital para fomentar el sistema de Peromyscus, y se espera que se benefician los demás.
Protocol
Inseminación artificial
La inseminación artificial se utiliza en lugar de cruces naturales para aumentar las probabilidades de que todas las mujeres han de quedar embarazada. Dos hombres se utilizó para cada uno hembras superovuladas o una mujer sabe que está en celo. El epidídimo caudae de ratones machos maduros fueron colocados en una suspensión de leche 9% y el tajo con agujas de calibre 18. El esperma se les permite nadar libremente durante unos minutos y luego los epidídimos fueron tomadas de la mezcla. La suspensión se evaluó con un microscopio en busca de la confluencia y espermatozoides móviles. Un contundente calibre 22 de 1 ½ pulgadas de largo aguja se utiliza para administrar los espermatozoides. Una curva de 120 º se colocó cerca de 3 / 4 de la bajada de la aguja. La aguja se introduce en la vagina hasta la curva y 0.025 - 0.05mls inyectado. Si un asistente se utiliza para mantener a la hembra en la posición adecuada, el uso de anestesia no es necesaria.
Preparación
- Use cuatro hombres por 6 mujeres
- La eutanasia a los hombres en el vivero
- Prepare unos 5 ml de leche 9% de la leche en polvo
- Poner 1,5 ml en placa de Petri pequeña
- Cortar el epidídimo y conducto deferente
- Poner en 1,5 ml de leche 9%
- El uso de dos agujas de calibre 18, y el uso de movimiento de corte largo con agujas, corte abierta el epidídimo y conductos deferentes para liberar el esperma
- Sacar a la izquierda sobre el tejido y comprobar que los espermatozoides bajo microscopio
Inyección
- Uso aguja sin punta en ángulo de 120 °
- Mantenga el ratón en la mano y se inyecta la mezcla. Si siente incómodo con una persona que tiene y por vía intravenosa, dos personas pueden ser utilizados. Sin anestesia se debe utilizar, como en uno sabe cómo puede afectar el procedimiento.
- Utilice 0.05 ml de la mezcla de esperma / leche por hembra
Destinatario mujeres
- Hacer un frotis vaginal en hembras receptoras (en ese momento las hembras receptor debe estar en el proestro / estro)
- Las hembras que no han llegado a estro para el día 5 probablemente no debería utilizarse
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Acknowledgments
Me gustaría dar las gracias a Mike Dewey desde el Centro de archivo Peromyscus genética por su valiosa información, la paciencia y el conocimiento sobre la reproducción de roedores.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-772-30 | |
| 18 G needle | Tool | BD Biosciences | 305195 | |
| Powdered milk | Reagent | Any Supplier | ||
| 1 mL syringe | Tool | National Scientific Company | S7510-1 | |
| Forceps | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14200-075 | |
| 22 G blunt needle | Tool | Give to me |
