מערך Multielectrode הקלטות של האפיתל Vomeronasal

Summary

מערך Multielectrode (MEA) הקלטות לספק שיטה ללימוד את הפעילות החשמלית של אוכלוסיות גדולות של נוירונים. כאן, אנו מציגים את הפרטים של הכנה MEA להקליט האפיתל עכבר vomeronasal ובמקביל מגרה את הרקמות.

Abstract

הבנת מעגלים עצביים דורש שיטות להקליט נוירונים רבים בו זמנית. עבור

Protocol

חלק 1. הקלטה חשמל מכשור

1. אנו משתמשים במערך multielectrode מישוריים (ALA מכשירים מדעיים) עם 10 מיקרומטר שטוח ניטריד טיטניום אלקטרודות מבודדים עם סיליקון ניטריד. 60 אלקטרודות מסודרים בשני תחומי המורכב מרשת 5x6 עם מרווח בין מרכז אל מרכז של 30 מיקרומטר. (תצורות אחרות גם אפשרי; אלקטרודות עם משטח הקלטה 10 מיקרומטר בקוטר טובים יותר אלקטרודות גדולות יותר במונחים של לבודד את הפעילות של נוירונים בודדים.)
2. אותות חשמליים הם מוגבר (הגברה 1000x) באמצעות מגבר 1060 MEA (ALA מכשירים מדעיים). איתותי נרכשים על 10 קילוהרץ באמצעות כרטיס רכישת נתונים (National Instruments) ותוכנות נתונים מותאמים אישית הרכישה (ניתן גם לרכוש תוכנה מסחרית).
3. רקמה נערכת על ידי MEA רשת ניילון (53 מיקרומטר), המצורף להוסיף מנהג אשר מתאים בנוחות בתוך הטבעת צינור תרבות של MEA.

חלק 2. משלוח נוזלי Instrumentation

1. רקמה דורש superfusion מתמשך, אשר אנו מבטיחים ידי אספקת פתרון של רינגר (115 נתרן mM כלוריד, אשלגן כלורי 5 מ"מ, 2 סידן כלוריד מ"מ, 2 מגנזיום כלוריד מ"מ, 25 סודיום ביקרבונט מ"מ, 10 HEPES מ"מ, 10 mM D-(+ )-גלוקוז) מהמשאבה HPLC. גירויים מוצגים על ידי ביצוע זריקות לתוך שסתום HPLC ומיתוג בין זרימה דרך הלולאה. גם המשאבה HPLC ומשאבה המזרק הרובוט של הזרקת מסופקים עם הפתרון של רינגר.
2. הפתרון של רינגר נשמר בתוך אמבט מים חמים (ISOTEMP 105) בשעה 42 ° C במשך הניסוי והוא מבעבע ברציפות עם 95% O ₂ / 5% CO _2. בקבוק נפרד של רינגר ללא גלוקוז מוכן גיבוי משאבת מזרק. הפתרון של רינגר מועבר אל הרקמה באמצעות משאבה 307 HPLC (Gilson) בשיעור של 3 mL / min. בניסוי טיפוסי 5-6 שעות, 1 ליטר של כל פתרון של רינגר מספיק.
3. במהלך הניסוי, הרקמה superfused ברציפות עם פתרון 37 ° C רינגר. בדיקה דוד ממוקם ישירות מעל הרקמה.
4. הגירויים מועברים באמצעות 215 הנדלר Gilson נוזלי זרוע רובוטית. גירויים מאוחסנים גומי הכתיר צלוחיות זכוכית, תחת שליטתו של תוכנה Gilson, הזרוע הרובוטית מספק את הגירויים לקו זלוף בעוד קצב הזרימה לחץ מתמיד ומתוחזקים.
5. המדינה של שסתום HPLC (לולאה עוסקת / לא עוסקת) מיוצגת על ידי מתח חשמלי, אשר נרשמו על ידי רכישת המחשב כערוץ נוסף כדי להבטיח סינכרון עם הפעילות העצבית.

חלק 3. הכנת MEA והתקן Stimulus משלוח

1. לפני ביצוע הנתיחה, למלא את MEA היטב עם BSA ב dH2O לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. שוטפים את MEA באמצעות חימום מבעבע הפתרון של רינגר והמקום MEA על הקרח.
3. ראש המטפל נוזל HPLC המשאבה על פי ההוראות של היצרן.

חלק 4. VNO Dissection

1. לפני ביצוע הנתיחה, למלא 2 60x15 מ"מ צלחות פטרי עם פתרון מבעבע של רינגר ומניחים על קרח. כמו כן למלא 2 Sylgard מנות מצופה פטרי באותו גודל עם הפתרון של רינגר ומניחים על קרח. צ'יל 50 מ"ל נוספים של חם מבעבע של רינגר לשימוש במהלך הניתוח.
2. העכבר הוא הקריב באמצעות מחנק CO ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם.
3. ודא חתכים דו צדדי מהצד של הפה, פועל במקביל לקו הלסת, לחלק האחורי של הראש. הצטרף 2 חתכים לאורך החלק האחורי של הצוואר ולהסיר את החלק הגבי של הראש, עוזב את הלסת התחתונה המצורפת לעכבר.
4. בעזרת מספריים בסדר, לחתוך בין רקמות לבין צד של עצם הלסת העליונה להפריד בין רקמות העצם.
5. שימוש ב # 3 מלקחיים, לקלף רקמות החיך לחשוף את חלל האף.
6. בעזרת מספריים קטנים או אזמל, לחתוך בין צד של 2 השיניים העליונות הקדמי כדי לשחרר את הקפסולה vomeronasal מן העצם.
7. שימוש ב # 3 מלקחיים, להרים את הקפסולה vomeronasal ידי עצם המקום שטוח בצלחת פטרי על הקרח. הצעדים דרך טבילה צריכה להתבצע תוך פחות מ 3 דקות.
8. מניחים את צלחת תחת stereomicroscope, מואר עם האור המוחזר. הוצא את הקפסולה גרמי מ VNO אחד בכל פעם, באמצעות # 3 מלקחיים. השתמש יד אחת כדי לייצב את הקפסולה הגרמי על ידי מרתק מקצה הזנב, היד השנייה לקלף העצם הרחק VNO, נזהרת שלא לפגוע VNO.
9. כאשר עצם מוסר, העברת VNO אל צלחת פטרי Sylgard מצופה. השתמש צלחת שנותר VNO השני. כבה את התאורה על האור המועבר.
10. באמצעות מיקרו מספריים או מלקחיים # 5, להפריד את VNO מתוך כלי הדם על ידי חיתוך לאורך הקצה של VNO. בשלב זה אתהיש את הגיליון עצביים מופרדים לגמרי כלי הדם.
11. מניחים את VNO עם את (דנדריטים) בצד הפנימי. שימוש ב # 3 מלקחיים, כדי לעגן את VNO Sylgard בפינה של הרקמה. מקלפים את האפיתל עצביים מן lamina הבסיס באמצעות שבר קטן של להב מצופה טפלון גילוח שקיים עם מלחציים. החזקת את הלהב בזווית רדוד (<30 מעלות מעל פני צלחת) הוא הטוב ביותר.
12. בעזרת פיפטה כוס, להעביר את פיסת אפיתל עצביים מצלחת של MEA. מקם את VNO על גבי שדה אלקטרודה עם הצד הדנדריטים למעלה. הסר פתרון Ringer של עודף עם טפטפת. המקום בעל רקמה רשת לתוך הבאר של המערך לקיים את VNO במקום, ולמלא בתמיסת רינגר של צונן.

חלק 5. הקלטה

1. מניחים את MEA ב מגבר MEA 1060 ואת עמדת בדיקה דוד ישירות מעל הרקמה.
2. כדי לאשר את המיקום הנכון בדיקה דוד, לגרות עם הפתרון של רינגר המכיל אשלגן 50 מ"מ (תחליף נתרן equimolar) למשך 2 שניות. התאם את מיקום כדי לצמצם את ההשהיה של התגובה העצבית לפתרון אשלגן.
3. Superfuse הרקמה בתמיסת רינגר של מחומם למשך שעה 45 דקות עד 1 לפני ההקלטה כדי לאפשר לרקמות להסתגל.
4. האותות החשמליים נשמרים בדיסק באמצעות תוכנות הקלטה אישית.

חלק 6. ניתוח נתונים

1. מנותק ניתוח נתונים יכול להיעשות באמצעות הקלטות אלקטרודה גלם. לדוגמה, אנו מודדים את השינויים קצב ירי של תאים רשמה בתגובה ligands בפרט. ערכות נתונים המתקבלים גדול יכול לשמש כדי לענות על שאלות שונות, הכרות עם שפת תכנות או ניתוח (C, Matlab, R, Python, או דומה) נדרשת.

חלק 7. נציג תוצאות

הכנה זו היא בדרך כלל יציבה מספיק כדי להקליט במשך 6 שעות, מניב כמות גדולה של נתונים (6 שעות של הקלטה מתוך 60 אלקטרודות).

באיור 1. תמונה של פעילות בו זמנית על פני חצי אחד של המערך מוצג. חלון הזמן משתרע על פני 400 ms. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

איור 2. בניסוי אופייני, אנו מעוררים עם תרכובות מסוים של ריבית למשך 10 שניות. עקבות זוהי דוגמה של בתגובה שתן עכבר מדולל פי 100 נשים. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

Discussion

מערך הקלטות Multielectrode לאפשר לנו את היכולת לפקח על הפעילות סימולטני של אוכלוסייה גדולה של נוירונים. זהו כלי שימושי עבור לחקור את המאפיינים של מערכת החושים, במיוחד את VNO. בניגוד למערכת חוש הריח העיקרי, VNO מזהה גירויים בשלב נוזלי. בנוסף, VNO היא רקמה הטרוגנית. ישנם כ 300 סוגים שונים של קולטנים את העכבר ^1, ככל הנראה עם פרופילים תגובה שונה. הקלטות MEA בשילוב עם הזרוע הרובוטית מאפשרים לנו לספק באופן אמין גירויים נוזלי לאוכלוסייה גדולה ומגוונת של נוירונים וזהות תגובה electrophysiologically. בנוסף, היציבות של VNO במבחנה מאפשרת הזמן חוזר מרובים של גירוי.

בעבר, בטכניקה זו נעשה שימוש כדי לחקור את המאפיינים של חושי VSNs בתגובה שתן העכבר ^2, כמו גם לשמש assay אמינה לזיהוי ligands בודדים בשתן ^3. בעתיד, טכניקה זו עשויה להיות שימושית מאוד לגילוי ליגנד נוסף באפיון תכונות חושית של VNO.