Enregistrements tableau multiélectrodes de l'épithélium Vomeronasal

Summary

Multiélectrodes array (MEA) enregistrements fournissent une méthode pour étudier l'activité électrique des grandes populations de neurones. Ici, nous présentons les détails d'une préparation de la MEA pour enregistrer à partir de l'épithélium de souris voméronasal tout en stimulant le tissu.

Abstract

Comprendre les circuits neuronaux nécessite des méthodes pour enregistrer à partir de nombreux neurones simultanément. Pour

Protocol

Partie 1. Instrumentation enregistrement électrique

1. Nous utilisons un large multiélectrodes planaires (ALA Scientific Instruments) avec 10 um électrodes plates de nitrure de titane isolé avec du nitrure de silicium. 60 électrodes sont disposées dans deux domaines constitué d'un quadrillage 5x6 avec le centre à centre espacement de 30 um. (D'autres configurations sont également possibles; électrodes avec une surface d'enregistrement 10 m de diamètre sont mieux que les grandes électrodes en termes d'isoler l'activité des neurones individuels.)
2. Les signaux électriques sont amplifiées (amplification 1000x) en utilisant un amplificateur de MEA 1060 (ALA Scientific Instruments). Les signaux sont acquis à 10 kHz en utilisant une carte d'acquisition de données (National Instruments) et de logiciels personnalisés d'acquisition de données (on peut également acheter des logiciels commerciaux).
3. Le tissu est maintenu sur l'AEM par un filet de nylon (53 um), qui est attaché à une insertion personnalisé qui s'adapte parfaitement à l'intérieur de l'anneau tubulaire de la culture de la MEA.

Partie 2. Instrumentation distribution de liquide

1. Le tissu nécessite surfusion continue, que nous garantissons en fournissant une solution de Ringer (115 de chlorure de sodium mM, 5 mM de chlorure de potassium, 2 chlorure de calcium mm, 2 de chlorure de magnésium mm, 25 bicarbonate de sodium mM, 10 mM d'HEPES et 10 mM de D-(+ )-glucose) à partir d'une pompe HPLC. Les stimuli sont présentés en effectuant des injections dans une vanne de CLHP et de commutation entre les actions accréditives et de la boucle. Tant la pompe HPLC et seringue d'injection du robot sont fournis avec la solution de Ringer.
2. La solution de Ringer est maintenu dans un bain d'eau chauffée (ISOTEMP 105) à 42 ° C toute l'expérience et est continuellement à barboter avec 95% d'O ₂ / 5% CO _2. Un ballon séparé de Ringer sans glucose est préparé pour la sauvegarde de la pompe à seringue. Solution de Ringer est délivrée au tissu en utilisant une pompe HPLC 307 (Gilson) à un taux de 3 ml / min. Dans un typique 5-6 expérimentation heures, 1 L de solution de Ringer chaque est suffisante.
3. Tout au long de l'expérience, le tissu est continuellement perfusées avec 37 ° C une solution de Ringer. Une sonde radiateur est positionné directement au-dessus du tissu.
4. Les stimuli sont livrés avec le bras de Gilson 215 Handler liquide robotisé. Les stimuli sont stockés dans des flacons en verre de caoutchouc plafonnés, et sous le contrôle des logiciels de Gilson, le bras robotique fournit les stimuli à la ligne de perfusion alors que le taux de débit et pression constantes sont maintenues.
5. L'état de la vanne HPLC (boucle engagés / non engagé) est représenté par une tension électrique, qui est enregistré par l'ordinateur d'acquisition comme un canal supplémentaire pour assurer la synchronisation avec l'activité neuronale.

Partie 3. Préparation de la MEA et dispositif de livraison de stimulation

1. Avant de procéder à la dissection, remplissez le MEA bien avec BSA dans dH2O pendant au moins 5 minutes à température ambiante.
2. Rincez à l'aide de la MEA warm-buller solution de Ringer et le lieu de la MEA sur la glace.
3. Premier gestionnaire de liquide et pompe HPLC selon les instructions du fabricant.

Partie 4. Dissection VNO

1. Avant d'effectuer la dissection, remplissez 2 60x15 mm boîtes de Pétri avec une solution de Ringer et barbotage placer sur la glace. Remplissez également deux Sylgard revêtement des boîtes de Petri de la même taille avec une solution de Ringer et le placer sur la glace. Réfrigérer une 50mL supplémentaire de warm-buller Ringer pour une utilisation lors de la dissection.
2. La souris est sacrifiée par asphyxie CO ₂ suivie par dislocation cervicale.
3. Faire des incisions bilatérales du côté de la bouche, parallèle à la ligne de la mâchoire, à l'arrière de la tête. Rejoignez les deux coupes le long du dos de la nuque et retirez la partie dorsale de la tête, laissant la mâchoire inférieure attachée à la souris.
4. Avec des ciseaux fins, coupés entre le tissu et de chaque côté de l'os maxillaire supérieur pour séparer les tissus de l'os.
5. En utilisant une pince # 3, décoller le tissu palais à exposer la cavité nasale.
6. L'utilisation de petits ciseaux ou un scalpel, couper entre et de chaque côté de la tige 2 dents de devant pour libérer la capsule voméronasal de l'os.
7. En utilisant une pince # 3, ramasser la capsule voméronasal par l'os plat et le placer dans la boîte de Pétri sur la glace. Les étapes à travers l'immersion devrait être effectué en moins de 3 minutes.
8. Placer le plat sous un stéréomicroscope, éclairé par la lumière réfléchie. Retirez la capsule osseuse d'un VNO à un moment à l'aide n ° 3 pinces. Utilisez une main pour stabiliser la capsule osseuse par serrage de l'extrémité caudale et l'autre main pour éplucher l'os loin du VNO, en prenant soin de ne pas endommager le VNO.
9. Lorsque l'os est enlevé, le transfert du VNO à une boîte de Pétri Sylgard couché. Utilisez le plat reste pour le VNO autres. Mettre l'éclairage à lumière transmise.
10. L'utilisation de micro-ciseaux ou # 5 forceps, séparer le VNO à partir du vaisseau sanguin en coupant le long du bord de tIl VNO. À ce stade, vous aurez la feuille de neurones complètement séparé du vaisseau sanguin.
11. Placez le VNO à la place de côté (dendritiques) interne. En utilisant une pince # 3, ancrer le VNO à l'Sylgard à un coin du tissu. Peler l'épithélium neuronal de la lame basale en utilisant un petit fragment d'une lame de rasoir en téflon tenue avec une pince. En tenant la lame à un angle faible (<30 ° de la surface de plat) est le meilleur.
12. En utilisant une pipette en verre, le transfert de la pièce de l'épithélium neural de l'antenne à l'AEM. Position du VNO sur le dessus de l'électrode sur le terrain avec le côté jusqu'à dendritiques. Retirer l'excès de solution de Ringer avec une pipette. Placez le porte-mailles du tissu dans le puits de la matrice de tenir le VNO en place, et le remplir d'une solution de Ringer réfrigérée est.

Partie 5. Enregistrement

1. Placez la MEA dans un MEA 1060 amplificateur et la position de la sonde chauffe directement au-dessus du tissu.
2. Pour confirmer le placement correct de sonde de chauffage, de stimuler avec une solution de Ringer contenant 50 mM de potassium (substitué pour le sodium équimolaire) pendant 2 secondes. Ajustez le positionnement de minimiser la latence de la réponse neuronale à la solution de potassium.
3. Superfuse le tissu avec une solution de Ringer chauffée pendant 45 minutes à 1 heure avant l'enregistrement pour permettre au tissu de s'acclimater.
4. Les signaux électriques sont sauvegardées sur le disque en utilisant un logiciel d'enregistrement personnalisés.

Partie 6. Analyse des données

1. Hors analyse des données peut être fait en utilisant les enregistrements d'électrode premières. Par exemple, nous mesurons les changements cadence de tir de cellules enregistrées en réponse à des ligands particulier. Les ensembles de données qui en résultent sont grands et peuvent être utilisés pour traiter de nombreuses questions différentes; familiarité avec un langage de programmation ou d'analyses (C, Matlab, R, Python, ou similaire) est nécessaire.

Partie 7. Les résultats représentatifs

Cette préparation est généralement assez stable pour enregistrer à partir de 6 heures, ce qui donne une grande quantité de données (6 heures d'enregistrement de 60 électrodes).

Figure 1. Un instantané de l'activité simultanée à travers une moitié du tableau est montré. La fenêtre de temps s'étend de 400 ms.

Figure 2. Dans une expérience typique, nous stimulons par des composés d'intérêt particulier pour les 10 secondes. Cette trace est un exemple d'une réponse à 100 fois l'urine de souris dilué femelle.

Discussion

Enregistrements array multiélectrodes nous permettent la possibilité de surveiller l'activité simultanée d'une population importante de neurones. C'est un outil utile pour sonder les propriétés d'un système sensoriel, en particulier le VNO. Contrairement au système olfactif principal, le VNO détecte les stimuli en phase liquide. En outre, le VNO est un tissu hétérogène. Il ya environ 300 types différents de récepteurs chez la souris ^une, sans doute avec des profils de réponse différents. Enregistrements MEA combiné avec le bras robotique nous permet de livrer de manière fiable des stimuli liquide à une population importante et diversifiée de neurones et de l'identité d'une réponse électrophysiologique. En outre, la stabilité du VNO in vitro permet de temps pour des répétitions multiples d'un même stimulus.

Auparavant, cette technique a été utilisée pour étudier les propriétés sensorielles du VSN en réponse à l'urine de souris ² ainsi que servir de test fiable pour identifier des ligands individuels présents dans l'urine ^3. Dans l'avenir, cette technique peut être très utile pour la découverte du ligand plus loin et à caractériser les propriétés sensorielles du VNO.