Multielectrode Array inspelningar av vomeronasala Epitel

Summary

Multielectrode array (MEA) inspelningar ger en metod för att studera den elektriska aktiviteten i stora populationer av nervceller. Här presenterar vi information om en MEA förberedelse för att spela in från mus vomeronasala epitelet samtidigt stimulera vävnaden.

Abstract

Förstå nervbanor kräver metoder för att spela in från många nervceller samtidigt. För

Protocol

Del 1. Elektrisk inspelning Instrumentering

1. Vi använder en plan multielectrode array (ALA vetenskapliga instrument) med 10 mikrometer plana elektroder titannitrid isolerad med kiselnitrid. 60 elektroder placerade i två områden som består av ett 5x6 rutnät med centrum till närmaste håls centrum på 30 ìm. (Andra konfigurationer är också möjliga, elektroder med en inspelning yta 10 mikrometer i diameter är bättre än större elektroder i form av isolera aktiviteten av enskilda nervceller.)
2. Elektriska signaler förstärks (1000x förstärkning) med hjälp av en MEA 1060 förstärkare (ALA vetenskapliga instrument). Signaler förvärvas vid 10 kHz med hjälp av ett datainsamlingssystem kort (National Instruments) och anpassade datainsamling programvara (man kan också köpa kommersiell programvara).
3. Vävnaden hålls nere på MEA av en nylon mesh (53 mikrometer), som är knuten till en anpassad sätta in som passar väl i kultur röret ring MEA.

Del 2. Flytande Leverans Instrumentation

1. Vävnaden kräver kontinuerlig superfusion, vilket garanterar vi genom att leverera Ringers lösning (115 mM natriumklorid, 5 mm kaliumklorid, 2 mm kalciumklorid, 2 mM magnesiumklorid, 25 mm natriumbikarbonat, 10 mm HEPES, och 10 mm D-(+ )-glukos) från en HPLC-pump. Stimuli presenteras genom att göra injektioner i en HPLC-ventil och växlar mellan genomströmning och loopen. Både HPLC pumpen och injektionen robotens sprutpump levereras med Ringers lösning.
2. Ringer-lösning förvaras i ett uppvärmt vattenbad (ISOTEMP 105) vid 42 ° C under hela försöksperioden och är ständigt bubblade med 95% O ₂ / 5% CO _2. En separat kolv Ringer utan glukos är förberedd för säkerhetskopiering sprutpumpen. Ringers lösning levereras till vävnaden med hjälp av en 307 HPLC pump (Gilson) med en hastighet av 3 ml / min. I en typisk 5-6 timmars experimentet är 1 L i varje Ringers lösning tillräcklig.
3. Under hela försöket är vävnaden kontinuerligt superfused med 37 ° C Ringers lösning. En värmare Sonden placeras direkt ovanför vävnaden.
4. Stimuli levereras med Gilson 215 Likvida Handler robotarm. Stimuli lagras i gummi-begränsade glasflaskor och under kontroll av Gilson programvara levererar robotarmen stimuli till perfusion linje medan konstant flöde och tryck bibehålls.
5. Tillståndet för HPLC-ventil (en slinga engagerade / inte bedriver) representeras av en elektrisk spänning som registreras av förvärvet datorn som en extra kanal för att säkerställa synkronisering med nervaktivitet.

Del 3. Förbereda MEA och stimulans leverans enhet

1. Före utför dissektion, fyll MEA väl med BSA i dH2O i minst 5 minuter i rumstemperatur.
2. Skölj MEA med varma bubblade Ringers lösning och placera MEA på is.
3. Prime vätskan hundföraren och HPLC pumpen enligt tillverkarens anvisningar.

Del 4. VNO Dissection

1. Innan du utför dissektion, fyller 2 60x15 mm petriskålar med bubblade Ringers lösning och lägg på is. Också fylla 2 Sylgard belagda petriskålar av samma storlek med Ringers lösning och lägg på is. Chill ytterligare 50 ml varm bubblade-Ringer för användning under dissekering.
2. Musen offras via CO ₂ kvävning följt av halsdislokation.
3. Gör bilaterala snitt från sidan av munnen, som löper parallellt med käklinjen, på baksidan av huvudet. Bli medlem i två skär längs nacken och ta bort den dorsala delen av huvudet, lämnar underkäken knutna till musen.
4. Använda fin sax, klippa mellan vävnad och båda sidor av den övre käkbenet att separera vävnad från benet.
5. Använda # 3 pincett, dra av gommen vävnaden att exponera näshålan.
6. Använda en liten sax eller en skalpell, klippa mellan och på vardera sidan av de övre två framtänder för att befria vomeronasala kapsel från benet.
7. Använda # 3 pincett, plocka upp vomeronasala kapseln med den plana ben och plats i petriskål på is. De steg upp genom nedsänkning bör utföras på mindre än 3 minuter.
8. Placera skålen i ett stereomikroskop, belyst med reflekterat ljus. Ta bort den beniga kapseln från en VNO i taget med # 3 pincett. Använd en hand för att stabilisera beniga kapseln genom att ta tag i den bakre änden och andra sidan att skala benet bort från VNO, se till att inte skada VNO.
9. När benet tas bort, överföra VNO till en Sylgard belagda petriskål. Använd den återstående maträtt för andra VNO. Stäng av belysningen till ljus.
10. Med en mikro-sax eller # 5 pincett, separera VNO från blodkärlet genom att skära längs kanten av VNO. Vid denna punkt kommer du atthar de neurala arket är helt separerade från blodkärlet.
11. Placera VNO med den interna (dendritiska) sidan uppåt. Använda # 3 pincett, förankra VNO till Sylgard i ett hörn av vävnad. Skala neurala epitel från basala lamina med en liten fragment av en teflonbelagd rakbladet hålls med en klämma. Håll bladet på en flack vinkel (<30 ° från skålen ytan) är bäst.
12. Använda ett glas pipett biten av neurala epitel från skålen till MEA. Placera VNO ovanpå elektroden fältet med dendritiska uppåt. Ta bort överflödig Ringers lösning med en pipett. Placera hållaren mesh vävnaden i brunnen av arrayen att hålla VNO på plats och fyll på med kyld Ringers lösning.

Del 5. Inspelning

1. Placera MEA i en MEA 1060 förstärkare och placera värmaren sond direkt ovanför vävnaden.
2. För att bekräfta lämplig placering värmare sond, stimulera med Ringers lösning innehållande 50 mM kalium (ersätter ekvimolära natrium) i 2 sekunder. Justera placering för att minimera latens av neurala svar på kalium lösningen.
3. Superfuse vävnaden med uppvärmd Ringers lösning för 45 minuter till 1 timme före inspelningen så att vävnaden anpassa sig.
4. Elektriska signaler sparas till din hårddisk med anpassade inspelningsprogram.

Del 6. Data Analysis

1. Offline dataanalys kan göras med den råa elektroden inspelningar. Till exempel mäter vi eldhastighet förändringar av inspelat celler som svar på allt ligander. Den resulterande datamängder är stora och kan användas för att ta itu med många olika frågor, förtrogenhet med ett program eller analys språk (C, Matlab, R, Python eller liknande) krävs.

Del 7. Representativa resultat

Detta preparat är normalt tillräckligt stabil för att spela in från i 6 timmar, vilket ger en stor mängd data (6 timmars inspelning från 60 elektroder).

Figur 1. En ögonblicksbild av samtidig aktivitet i ena halvan av matrisen visas. Tidsfönstret spänner 400 ms. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.

Figur 2. I ett typiskt experiment, stimulerar vi särskilt med föreningar med intresse för 10 sekunder. Detta spår är ett exempel på ett svar på 100-faldig utspädning hanmöss urin. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.

Discussion

Multielectrode rad inspelningar ger oss möjlighet att övervaka samtidigt aktiviteten hos en stor population av nervceller. Detta är ett användbart verktyg för att sondera egenskaper hos ett sensoriskt system, specifikt VNO. Till skillnad från de viktigaste luktsinnet, upptäcker VNO stimuli i flytande fas. Dessutom är VNO en heterogen vävnad. Det finns ca 300 olika typer av receptorer i musen ^en, förmodligen med olika svar profiler. MEA inspelningar i kombination med robotarmen möjligt för oss att pålitligt leverera flytande stimuli till ett stort och varierat population av nervceller och identitet ett svar elektrofysiologi. Dessutom kan stabiliteten i VNO in vitro tid för flera ggr på en stimulans.

Tidigare har denna teknik använts för att undersöka sensoriska egenskaper VSNs svar på mus urin ² samt fungera som en tillförlitlig analys för att identifiera enskilda ligander som finns i urinen ^3. I framtiden kan denna teknik vara mycket nyttigt för att ytterligare ligand upptäckt och i kännetecknar de sensoriska egenskaper VNO.