Multielectrode Array Opnames van de Vomeronasal Epithelium

Summary

Multielectrode array (MEA) opnames een methode voor het bestuderen van de elektrische activiteit van grote groepen neuronen. Hier presenteren we de details van een MEA voorbereiding om op te nemen van de muis vomeronasale epitheel, terwijl tegelijkertijd het stimuleren van het weefsel.

Abstract

Inzicht in neurale circuits vereist methoden om tegelijkertijd op te nemen van vele neuronen. Voor

Protocol

Deel 1. Elektrische opnemen Instrumentatie

1. We maken gebruik van een vlakke multielectrode array (ALA Scientific Instruments) met 10 micrometer vlakke titanium nitride elektroden geïsoleerd met silicium nitride. 60 elektroden zijn gerangschikt in twee velden die bestaat uit een 5x6 rooster met hart-op-hart afstand van 30 micrometer. (Andere configuraties zijn ook mogelijk; elektroden met een opname-oppervlak 10 micrometer in diameter zijn beter dan grote elektroden op het gebied van het isoleren van de activiteit van enkele neuronen.)
2. Elektrische signalen worden versterkt (1000x versterking) met behulp van een MEA 1060 versterker (ALA Scientific Instruments). Signalen worden verworven op 10 kHz met behulp van een data-acquisitie kaart (National Instruments) en aangepaste data-acquisitie software (men kan ook de aankoop van commerciële software).
3. Het weefsel wordt vastgehouden aan de MEA door een nylon mesh (53 micrometer), die is bevestigd aan een op maat te voegen, die precies past in de cultuur buis ring van de MEA.

Deel 2. Vloeistof Levering Instrumentatie

1. Het weefsel vereist een continue superfusie, die we garanderen door het leveren van Ringer-oplossing (115 mM natriumchloride, 5 mM kaliumchloride, 2 mM calciumchloride, 2 mM magnesiumchloride, 25 mM natriumbicarbonaat, 10 mM HEPES, en 10 mM D-(+ )-glucose) van een HPLC-pomp. Stimuli worden gepresenteerd door het uitvoeren van injecties in een HPLC-klep en het schakelen tussen de doorstroming en de lus. Zowel de HPLC-pomp en de injectie-robot injectiepomp worden geleverd met Ringer's.
2. Ringer's oplossing wordt bewaard in een verwarmd waterbad (ISOTEMP 105) bij 42 ° C gedurende het hele experiment en is voortdurend borrelen met 95% O ₂ / 5% CO _2. Een aparte fles van Ringer, zonder glucose is voorbereid op de steun van de injectiepomp. Ringer-oplossing wordt geleverd aan het weefsel met behulp van een 307 HPLC-pomp (Gilson) met een snelheid van 3 ml / min. In een typisch 5-6 uur experiment, een L van de oplossing elke Ringer is voldoende.
3. Gedurende het experiment wordt het weefsel voortdurend superfused met 37 ° C oplossing Ringer's. Een verwarming sonde is geplaatst direct boven het weefsel.
4. Stimuli worden geleverd met behulp van de Gilson 215 Liquid Handler robotarm. Stimuli worden opgeslagen in rubber bedekte glazen flesjes, en onder de controle van Gilson software, de robotarm levert de prikkels naar de perfusie lijn terwijl constant debiet en druk worden gehandhaafd.
5. De toestand van de HPLC-klep (lus bezig / niet betrokken) wordt vertegenwoordigd door een elektrische spanning, die door de overname op de computer opgenomen als een extra kanaal om de synchronisatie te zorgen dat de neuronale activiteit.

Deel 3. De voorbereiding van de MEA-en Stimulus Delivery Device

1. Voorafgaand aan het uitvoeren van de dissectie, goed vul de MEA met BSA in dH2O voor minstens 5 minuten bij kamertemperatuur.
2. Spoel de MEA met behulp van warm-borrelen Ringer's oplossing en plaats de MEA op het ijs.
3. Prime de vloeistof handler en de HPLC-pomp volgens de instructies van de fabrikant.

Deel 4. VNO Dissection

1. Voor het uitvoeren van de dissectie, vul 2 60x15 mm petrischaaltjes met borrelen Ringer's en leg ze op ijs. Vul ook twee Sylgard gecoate petrischalen van dezelfde grootte met Ringer's en leg ze op ijs. Chill een extra 50 ml warm-geborreld Ringer's voor gebruik tijdens de dissectie.
2. De muis is opgeofferd via CO ₂ stikken, gevolgd door cervicale dislocatie.
3. Maak bilaterale incisies van de kant van de mond, loopt parallel aan de kaaklijn, aan de achterkant van het hoofd. Doe mee met de twee snijdt langs de achterkant van de nek en verwijder het dorsale deel van het hoofd, waardoor de onderkaak aan de muis.
4. Met behulp van fijne schaar, knip tussen het weefsel en de beide zijden van de bovenkaak bot om het weefsel te scheiden van het bot.
5. Met behulp van # 3 tang, haal het gehemelte weefsel om de neusholte bloot te leggen.
6. Met behulp van kleine schaar of een scalpel, knip tussen en aan weerszijden van de bovenste twee voortanden aan de vomeronasale capsule uit het bot vrij.
7. Met behulp van # 3 tang, pak de vomeronasale capsule door de platte bot en plaats in de petrischaal op het ijs. De stappen omhoog door onderdompeling moet worden uitgevoerd in minder dan 3 minuten.
8. Zet de schaal onder een stereomicroscoop, verlicht met gereflecteerd licht. Haal de capsule uit een benige VNO in een tijd met behulp van # 3 tang. Gebruik een hand om de benige capsule stabiliseren door pakkend vanaf het caudale einde en de andere hand te pellen het bot uit de buurt van het VNO, zorg ervoor dat u het VNO schade.
9. Wanneer het bot wordt verwijderd, de overdracht van de VNO om een ​​Sylgard gecoate petrischaal. Gebruik de resterende schotel voor de andere VNO. Schakel de verlichting voor doorvallend licht.
10. Met behulp van micro-schaar of # 5 tang, scheid de VNO uit het bloedvat door te snijden langs de rand van het VNO. Op dit punt heb jehebben de neurale plaat volledig gescheiden van het bloedvat.
11. Plaats de VNO met de interne (dendritische) omhoog. Met behulp van # 3 tang, anker het VNO om de Sylgard op een hoek van het weefsel. Schil de neurale epitheel van de basale lamina met behulp van een klein fragment van een Teflon-coating scheermesje gehouden met een klem. Houd het mes in een ondiepe hoek (<30 ° van de schotel oppervlak) is het beste.
12. Met behulp van een glazen pipet het stuk van de neurale epitheel van de schotel aan de MEA. Plaats de VNO op de top van de elektrode veld met de dendritische kant naar boven. Verwijder overtollig Ringer-oplossing met een pipet. Leg het gaas weefsel houder in de put van de array naar de VNO zijn plaats te houden, en met de oplossing gekoeld Ringer's te vullen.

Deel 5. Opname

1. Plaats de MEA in een MEA 1060 versterker en de positie van de verwarming sonde direct boven het weefsel.
2. Om te bevestigen een goede verwarming sonde plaatsing, te stimuleren met Ringer's oplossing met 50 mM kalium (de plaats van equimolaire natrium) voor 2 seconden. Stel positionering van de latency van de neurale respons op de kalium-oplossing te minimaliseren.
3. Superfuse het weefsel met de oplossing verwarmd Ringer's voor 45 minuten tot 1 uur voor de opname, zodat het weefsel om te acclimatiseren.
4. Elektrische signalen worden opgeslagen op de harde schijf met aangepaste opname-software.

Deel 6. Data Analysis

1. Offline data-analyse kan worden gedaan met behulp van de ruwe opnames elektrode. Bijvoorbeeld, meten we het afvuren van koerswijzigingen van de opgenomen cellen in reactie op bepaalde liganden. De resulterende data sets zijn groot en kunnen gebruikt worden om veel verschillende vragen te beantwoorden, bekendheid met een programmeer-of analyse taal (C, Matlab, R, Python, of vergelijkbaar) is vereist.

Deel 7. Representatieve resultaten

Dit preparaat is meestal stabiel genoeg om op te nemen van 6 uur, waardoor een grote hoeveelheid gegevens (6 uur opnametijd van 60 elektroden).

Figuur 1. Een momentopname van de gelijktijdige activiteiten over de ene helft van het array wordt weergegeven. Het tijdvenster overspant 400 ms. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.

Figuur 2. In een typisch experiment, stimuleren we met bijzondere verbindingen van belang zijn voor 10 seconden. Dit trace is een voorbeeld van een antwoord op de 100-voudig verdund vrouwelijke muizen urine. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien.

Discussion

Multielectrode reeks opnames laten ons de mogelijkheid om de gelijktijdige activiteit van een grote populatie van neuronen te controleren. Dit is een nuttig hulpmiddel voor het sonderen van de eigenschappen van een sensorisch systeem, met name het VNO. In tegenstelling tot de grote olfactorische systeem, het VNO detecteert stimuli in vloeibare fase. Daarnaast is de VNO is een heterogeen weefsel. Er zijn ongeveer 300 verschillende soorten receptoren in de muis ^een, vermoedelijk met een verschillende reactie profielen. MEA-opnamen gecombineerd met de robotarm stellen ons in staat om betrouwbaar vloeibare stimuli te leveren aan een grote en diverse populatie van neuronen en identiteit een reactie elektrofysiologische. Daarnaast is de stabiliteit van de VNO in vitro kan de tijd voor meerdere herhalingen van een stimulus.

Eerder is deze techniek is gebruikt om de sensorische eigenschappen van VSNs te onderzoeken in reactie op de muis urine ² en dienen als een betrouwbare test voor het identificeren van individuele liganden aanwezig zijn in de urine ^3. In de toekomst kan deze techniek zeer nuttig zijn om verder te ligand ontdekking en in het karakteriseren van de sensorische eigenschappen van het VNO.