Multielektroden Array Recordings der Vomeronasal Epithel

Summary

Multielektroden Array (MEA)-Aufnahmen stellen eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Aktivität des großen Populationen von Neuronen. Hier präsentieren wir die Details eines MEA Vorbereitung auf die von der Maus vomeronasalen Epithel aufzeichnen, während gleichzeitig die Förderung der Gewebe.

Abstract

Understanding neuronalen Schaltkreisen erfordert Methoden, um aus vielen Neuronen gleichzeitig aufzunehmen. Für

Protocol

Teil 1. Elektrische Recording Instrumentation

1. Wir verwenden eine planare Multielektroden array (ALA Scientific Instruments) mit 10 pm flache Titan-Nitrid-Elektroden mit Siliziumnitrid isoliert. 60 Elektroden sind in zwei Bereichen, bestehend aus einem 5x6-Gitter mit Mitte-zu-Zentrum-Abstand von 30 um angeordnet. (Andere Konfigurationen sind ebenfalls möglich; Elektroden mit einer Aufnahme Fläche 10 um im Durchmesser sind besser als größere Elektroden in Bezug auf die Isolierung der Aktivität einzelner Neuronen.)
2. Elektrische Signale werden verstärkt (1000x Verstärkung) mit einem MEA 1060 Verstärker (ALA Scientific Instruments). Die Signale werden bei 10 kHz mit einer Datenerfassungskarte (National Instruments) und kundenspezifische Software zur Datenerfassung (kann man auch kaufen kommerzielle Software) erworben.
3. Das Gewebe wird auf den MEA durch ein Nylonnetz (53 um), die eine benutzerdefinierte Einsatz, der genau passt in die Kultur Rohr Ring des MEA angebracht gehalten wird.

Part 2. Flüssige Lieferung Instrumentation

1. Das Gewebe erfordert eine kontinuierliche Superfusion, die wir garantieren, indem Ringer-Lösung (115 mM Natriumchlorid, 5 mM Kaliumchlorid, 2 mM Calciumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 25 mM Natriumhydrogencarbonat, 10 mM HEPES und 10 mM D-(+ )-Glucose) aus einer HPLC-Pumpe. Stimuli werden durch das Anwenden Injektionen in eine HPLC-Ventil und das Umschalten zwischen Flow-Through und die Schleife vorgestellt. Sowohl die HPLC-Pumpe und die Injektion des Roboters Spritzenpumpe mit Ringer-Lösung geliefert.
2. Ringer-Lösung wird in einem beheizten Wasserbad (ISOTEMP 105) bei 42 ° C während des gesamten Versuchs gehalten und wird kontinuierlich mit 95% O ₂ / 5% CO ₂ geleitet. Eine separate Flasche Ringerlösung ohne Glukose ist für die Sicherung der Spritzenpumpe vorbereitet. Ringer-Lösung ist, um das Gewebe mit A 307 HPLC-Pumpe (Gilson) mit einer Rate von 3 ml / min geliefert. In einem typischen Experiment 5-6 Stunden, 1 L der einzelnen Ringer-Lösung ausreichend.
3. Während des Experiments wird das Gewebe kontinuierlich mit 37 ° C Ringer-Lösung superfundiert. Eine Heizung Sonde befindet sich direkt oberhalb des Gewebes positioniert.
4. Stimuli werden geliefert mit dem Gilson-215-Liquid Handler Roboterarm. Stimuli werden in Gummi-capped Glasfläschchen gespeichert und unter der Kontrolle von Gilson-Software, liefert der Roboterarm die Reize auf die Durchblutung line während konstantem Durchfluss und Druck gehalten werden.
5. Der Zustand der HPLC-Ventil (loop engagierte / nicht aktiviert) wird durch eine elektrische Spannung, die durch den Erwerb Computer als einen zusätzlichen Kanal zur Synchronisation mit der neuronalen Aktivität zu gewährleisten aufgezeichnet vertreten.

Teil 3. Vorbereiten des MEA und Stimulus Lieferumfang Gerät

1. Vor Durchführung der Dissektion, füllen Sie die MEA gut mit BSA in dH2O für mindestens 5 Minuten bei Raumtemperatur.
2. Spülen Sie die MEA mit warm-sprudelte Ringer-Lösung und setzen Sie die MEA auf Eis.
3. Prime der Liquid Handler und HPLC-Pumpe nach den Anweisungen des Herstellers.

Teil 4. VNO Dissection

1. Vor der Durchführung der Dissektion, Fill 2 60x15 mm Petrischalen mit sprudelte Ringer-Lösung und auf Eis stellen. Auch Fill 2 Sylgard beschichteten Petrischalen von der gleichen Größe mit Ringer-Lösung und auf Eis stellen. Gefühlt einer zusätzlichen 50 mL von warm-sprudelte Ringer für den Einsatz während der Präparation.
2. Die Maus wird über CO ₂ Ersticken durch Genickbruch folgte geopfert.
3. Machen bilateralen Einschnitte von der Seite des Mundes, die parallel zur Kiefer-Linie, auf der Rückseite des Kopfes. Join the 2 Schnitte entlang der Rückseite des Halses und entfernen Sie den dorsalen Teil des Kopfes, so dass der Unterkiefer an der Maus.
4. Mit einer feinen Schere, schneiden Sie zwischen dem Gewebe und beiderseits der oberen Kieferknochen, um das Gewebe aus dem Knochen zu trennen.
5. Mit Nr. 3 Zangen, ziehen Sie die Gaumengewebe in die Nasenhöhle aussetzen.
6. Mit einer kleinen Schere oder ein Skalpell, zwischen und auf beiden Seiten der oberen 2 Schneidezähne, die vomeronasalen Kapsel aus dem Knochen frei geschnitten.
7. Mit Nr. 3 Zangen, nehmen Sie den vomeronasalen Kapsel durch den flachen Knochen und in der Petrischale auf Eis. Die Schritte oben durch Eintauchen sollte in weniger als 3 Minuten durchgeführt werden.
8. Die Schale unter einem Stereomikroskop mit Auflicht beleuchtet. Entfernen Sie die knöchernen Kapsel von einem VNO in einer Zeit mit Nr. 3 Zangen. Verwenden Sie eine Hand an den knöchernen Kapsel durch Ergreifen von der kaudalen Ende und die andere Hand zu schälen den Knochen weg von der VNO, kümmert sich nicht um die VNO Schaden zu stabilisieren.
9. Wenn der Knochen entfernt ist, übertragen Sie die VNO eine Sylgard beschichtete Petrischale. Verwenden Sie die restlichen Teller für die anderen VNO. Schalten Sie die Beleuchtung Durchlicht.
10. Mit Mikro-Schere oder Zange Nr. 5, trennen Sie die VNO aus dem Blutgefäß durch Schneiden entlang der Kante des VNO. An dieser Stelle werden Siehaben die neuronalen Blatt vollständig aus dem Blutgefäß getrennt.
11. Legen Sie die VNO mit dem internen (dendritischen) nach oben. Mit Nr. 3 Zangen, Anker der VNO der Sylgard an einer Ecke des Gewebes. Schälen Sie die neuralen Epithel von der Basalmembran mit einem kleinen Fragment eines Teflon-beschichtete Rasierklinge mit einer Klammer gehalten. Halten Sie die Klinge in einem flachen Winkel (<30 ° aus der Schale Oberfläche) am besten ist.
12. Mit einer Glaspipette, Übertragung des Stückes von neuralen Epithel aus der Schale der MEA. Position der VNO auf der Elektrode Feld mit den dendritischen Seite nach oben. Entfernen Sie überschüssiges Ringer-Lösung mit einer Pipette. Legen Sie die Mesh-Gewebe Inhaber in den Brunnen des Arrays der VNO in Position zu halten, und füllen Sie mit gekühlten Ringer-Lösung.

Teil 5. Aufnahme

1. Legen Sie die MEA in einer MEA 1060 Verstärker und die Position der Heizung Sonde direkt über das Gewebe.
2. Um zu bestätigen, richtige Heizung Aufsetzen der Sonde, mit Ringer-Lösung mit 50 mM Kalium-(substituierte für äquimolare Natrium) für 2 Sekunden zu stimulieren. Passen Sie die Positionierung, um die Latenz der neuronalen Antwort auf die Kalium-Lösung zu minimieren.
3. Superfuse das Gewebe mit beheiztem Ringer-Lösung für 45 Minuten bis 1 Stunde vor der Aufnahme, damit das Gewebe sich zu akklimatisieren.
4. Elektrische Signale werden auf die Festplatte mithilfe von benutzerdefinierten Recording-Software gespeichert.

Teil 6. Data Analysis

1. Offline-Daten-Analyse kann mit dem rohen Elektrode Aufnahmen werden. Zum Beispiel messen wir die Feuerrate Veränderungen der aufgezeichneten Zellen in Reaktion auf bestimmte Liganden. Die daraus resultierenden Datenmengen sind groß und kann auf viele verschiedene Fragen zu beantworten sein; Vertrautheit mit einem Programmier-oder Analyse Sprache (C, Matlab, R, Python, o.ä.) erforderlich ist.

Teil 7. Repräsentative Ergebnisse

Dieses Präparat ist in der Regel stabil genug, um von 6 Stunden aufnehmen, was eine große Menge von Daten (6 Stunden Aufnahmezeit von 60 Elektroden).

Abbildung 1. Eine Momentaufnahme der gleichzeitige Tätigkeit in einer Hälfte des Arrays angezeigt. Das Zeitfenster reicht 400 ms. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

Abbildung 2. In einem typischen Experiment, arbeiten wir mit speziellen Verbindungen von Interesse zu wecken für 10 Sekunden. Diese Spur ist ein Beispiel für eine Reaktion auf die 100-fach verdünnt weiblichen Maus Urin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

Discussion

Multielektroden Array-Aufnahmen ermöglichen es uns die Möglichkeit, die gleichzeitige Tätigkeit von einer großen Population von Neuronen zu überwachen. Dies ist ein nützliches Werkzeug für die Erforschung der Eigenschaften eines sensorischen Systems, insbesondere des VNO. Im Gegensatz zu den wichtigsten olfaktorischen System, erkennt das VNO Reize in der flüssigen Phase. Darüber hinaus ist das VNO ein heterogenes Gewebe. Es gibt ungefähr 300 verschiedene Arten von Rezeptoren in der Maus ^1, vermutlich mit unterschiedlichen Profilen Antwort. MEA-Aufnahmen mit dem Roboterarm verbunden erlauben uns, zuverlässig liefern Flüssigkeit Impulse für eine große und vielfältige Population von Neuronen und Identität eine Antwort elektrophysiologisch. Darüber hinaus ermöglicht die Stabilität des VNO in vitro Zeit für mehrere Wiederholungen eines Reizes.

Bisher wurde diese Technik verwendet, um die sensorischen Eigenschaften von VSNs in Reaktion auf Maus Urin untersuchen ² sowie als zuverlässiger Test zur Identifizierung von einzelnen Liganden im Urin ³ dienen. In Zukunft könnte diese Technik sehr nützlich sein, um weitere Liganden Entdeckung und Charakterisierung der sensorischen Eigenschaften der VNO.