Array registrazioni Multielectrode dell'epitelio Vomeronasal

Summary

Multielectrode array (MEA), le registrazioni forniscono un metodo per studiare l'attività elettrica di ampie popolazioni di neuroni. Qui, vi presentiamo i dettagli di una preparazione MEA per registrare dal epitelio del mouse vomeronasale mentre simultaneamente stimola il tessuto.

Abstract

Comprensione circuiti neurali richiede metodi per registrare da molti neuroni contemporaneamente. Per

Protocol

Parte 1. Registrazione Strumentazione elettrica

1. Usiamo una schiera planare multielectrode (ALA Strumenti scientifici) con 10 elettrodi in nitruro di titanio micron piatto isolato con nitruro di silicio. 60 elettrodi sono disposti in due campi formato da una griglia 5x6 con centro a centro distanza di 30 micron. (Altre configurazioni sono possibili; elettrodi con una superficie di registrazione 10 micron di diametro, sono migliori rispetto alle grandi elettrodi in termini di isolare l'attività dei singoli neuroni.)
2. I segnali elettrici sono amplificati (amplificazione 1000x) utilizzando un MEA 1060 amplificatore (ALA Strumenti scientifici). I segnali vengono acquisiti a 10 kHz utilizzando una scheda di acquisizione dati (National Instruments) e personalizzati software di acquisizione dati (si può anche acquistare il software commerciale).
3. Il tessuto viene tenuto premuto sulla MEA da una maglia di nylon (53 micron), che è collegato a un inserto personalizzata che si adatta perfettamente all'interno dell'anello cultura tubo del MEA.

Parte 2. Consegna Strumentazione liquido

1. Il tessuto richiede superfusione continuo, che possiamo garantire, fornendo la soluzione di Ringer (115 cloruro di sodio mm, 5 mm cloruro di potassio, 2 cloruro di calcio mM, 2 cloruro di magnesio mm, 25 bicarbonato di sodio mm, 10 HEPES mM e 10 mM D-(+ )-glucosio) da una pompa HPLC. Gli stimoli sono presentati eseguendo iniezioni in una valvola di HPLC e il passaggio tra flow-through e il ciclo. Sia la pompa HPLC e pompa a siringa del robot di iniezione sono forniti con la soluzione di Ringer.
2. Ringer è tenuto in un bagno di acqua riscaldata (Isotemp 105) a 42 ° C durante tutto l'esperimento ed è continuamente bollito con il 95% O ₂ / 5% di CO _2. Un fiasco separata di Ringer senza glucosio è preparato per sostenere la pompa a siringa. Ringer viene consegnato al tessuto utilizzando un HPLC 307 pompa (Gilson) ad una velocità di 3 ml / min. In un tipico esperimento di 5-6 ore, 1 litro di soluzione ogni Ringer è sufficiente.
3. Tutto l'esperimento, il tessuto è in continuo superfused con 37 ° C la soluzione di Ringer. Una sonda riscaldamento è posizionata direttamente sopra il tessuto.
4. Gli stimoli vengono consegnati con il liquido Gilson 215 braccio robotico Handler. Gli stimoli vengono memorizzati in gomma-capped fiale di vetro, e sotto il controllo del software Gilson, il braccio robotico offre gli stimoli alla linea di perfusione, mentre la portata e pressione costanti sono mantenute.
5. Lo stato della valvola HPLC (anello impegnato / non impegnati) è rappresentato da una tensione elettrica, che viene registrata dal computer di acquisizione come un canale supplementare per garantire la sincronizzazione con l'attività neuronale.

Parte 3. Preparazione della MEA e dispositivo di erogazione Stimolo

1. Prima di eseguire la dissezione, riempire il MEA bene con BSA in dH2O per almeno 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Sciacquare la MEA utilizzando warm-bolle Ringer soluzione e posizionare il MEA sul ghiaccio.
3. Primo il gestore di liquido e pompe HPLC secondo le istruzioni del produttore.

Parte 4. VNO Dissection

1. Prima di eseguire la dissezione, riempire 2 piatti 60x15 millimetri Petri con bollito soluzione di Ringer e posto sul ghiaccio. Anche riempire 2 Sylgard piatti rivestiti Petri della stessa dimensione con la soluzione di Ringer e posto sul ghiaccio. Freddo uno 50mL aggiuntivo di warm-bollito Ringer per l'uso durante la dissezione.
2. Il mouse è sacrificato tramite CO ₂ asfissia seguita da dislocazione cervicale.
3. Fai incisioni bilaterali dal lato della bocca, che corre parallela alla linea della mascella, alla parte posteriore della testa. Partecipa al 2 tagli lungo la parte posteriore del collo e togliere la parte dorsale della testa, lasciando la mascella inferiore attaccato al mouse.
4. Utilizzando forbici, tagliare tra il tessuto e ai lati della mascella superiore per separare il tessuto dall'osso.
5. Utilizzando # 3 pinze, staccare il tessuto palato per esporre la cavità nasale.
6. Utilizzando piccole forbici o un bisturi, tagliare tra e su entrambi i lati della tomaia 2 denti anteriori per liberare la capsula vomeronasale dall'osso.
7. Utilizzando # 3 pinze, prendere la capsula vomeronasale dalle ossa piatte e posto nella scatola di Petri sul ghiaccio. I passi attraverso l'immersione deve essere eseguita in meno di 3 minuti.
8. Porre la capsula sotto uno stereomicroscopio, illuminata con luce riflessa. Rimuovere la capsula ossea da un VNO alla volta utilizzando # 3 pinze. Usare una mano per stabilizzare la capsula ossea da presa a partire dalla fine caudale e l'altra mano per sbucciare l'osso dalla VNO, facendo attenzione a non danneggiare la VNO.
9. Quando l'osso viene rimosso, trasferire il VNO Sylgard ad un piatto rivestito di Petri. Utilizzare il piatto rimanenti per il VNO altri. Passa l'illuminazione a luce trasmessa.
10. Utilizzando micro-forbici o pinze # 5, separare il VNO dal vaso sanguigno, tagliando lungo il bordo del VNO. A questo punto sihanno il foglio neurali completamente separato dal vaso sanguigno.
11. Posizionare il VNO con l'interno (dendritiche) fino laterali. Utilizzando # 3 pinze, ancora il VNO al Sylgard in un angolo del tessuto. Sbucciate l'epitelio neurale dalla lamina basale con un piccolo frammento di rivestita in teflon lama di rasoio tenuto con una fascetta. Tenendo la lama con un angolo basso (<30 ° rispetto alla superficie del piatto) è il migliore.
12. Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire il pezzo di epitelio neurale dal piatto alla MEA. Posizionare il VNO sulla parte superiore del campo di elettrodi con il lato alto dendritiche. Rimuovere la soluzione di Ringer in eccesso con una pipetta. Posizionare il supporto del tessuto mesh nel pozzo della matrice per tenere il VNO a posto, e riempire con soluzione di Ringer refrigerata è.

Parte 5. Registrazione

1. Posizionare il MEA in un amplificatore 1060 MEA e posizionare la sonda riscaldamento direttamente sopra il tessuto.
2. Per confermare il posizionamento corretto della sonda riscaldamento, stimolare con la soluzione di Ringer contenente 50 mM di potassio (sostituito sodio equimolari) per 2 secondi. Regolare il posizionamento di ridurre al minimo la latenza della risposta neurale alla soluzione di potassio.
3. Superfuse il tessuto con una soluzione di Ringer riscaldata per 45 minuti a 1 ora prima della registrazione per consentire il tessuto si adatti.
4. I segnali elettrici vengono salvati su hard disk utilizzando software personalizzato di registrazione.

Parte 6. Analisi dei dati

1. Offline analisi dei dati può essere fatto utilizzando le registrazioni elettrodo prime. Per esempio, si misura la variazione dei tassi di cottura delle cellule registrate in risposta a ligandi particolare. I set di dati risultanti sono grandi e possono essere utilizzate per affrontare molte questioni diverse, la familiarità con un linguaggio di programmazione o di analisi (C, Matlab, R, Python, o simili) è richiesto.

Parte 7. Rappresentante Risultati

Questa preparazione è in genere abbastanza stabile per registrare da per 6 ore, producendo una grande quantità di dati (6 ore di registrazione da 60 elettrodi).

Figura 1. Un'istantanea di attività simultanee su una metà della matrice è mostrato. La finestra temporale si estende su 400 ms. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.

Figura 2. In un tipico esperimento, stimoliamo con particolari composti di interesse per 10 secondi. Questa traccia è un esempio di una risposta a 100 volte l'urina diluita topo femmina. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.

Discussion

Registrazioni serie Multielectrode ci permette la possibilità di monitorare l'attività simultanea di una grande popolazione di neuroni. Questo è un utile strumento per sondare le proprietà di un sistema sensoriale, in particolare il VNO. A differenza del sistema olfattivo principale, il VNO rileva stimoli in fase liquida. Inoltre, il VNO è un tessuto eterogeneo. Ci sono circa 300 tipi diversi di recettori nel topo ^1, presumibilmente con profili di risposta diversa. Registrazioni MEA combinato con il braccio robotico ci permettono di fornire stimoli affidabile liquido ad una popolazione vasta e diversificata di neuroni e l'identità di una risposta elettrofisiologico. Inoltre, la stabilità del VNO in vitro consente tempo per la ripete più di uno stimolo.

In precedenza, questa tecnica è stata utilizzata per studiare le proprietà sensoriali del VSNs in risposta alle urine del mouse ² nonché servire come test affidabile per identificare ligandi individuali presenti nelle urine ^3. In futuro, questa tecnica può essere molto utile alla scoperta ligando ulteriormente e nella caratterizzazione delle proprietà sensoriali del VNO.