Grabaciones multielectrodo matriz del epitelio vomeronasal

Summary

Multielectrodo array (MEA) grabaciones de proporcionar un método para estudiar la actividad eléctrica de las grandes poblaciones de neuronas. Aquí se presentan los detalles de una preparación de MEA para grabar desde el epitelio vomeronasal del ratón al mismo tiempo estimular el tejido.

Abstract

Entender los circuitos neuronales requiere de métodos de registro de las neuronas de manera simultánea. Para

Protocol

Parte 1. Instrumentación de grabación eléctrica

1. Utilizamos una amplia multielectrodo planar (ALA Scientific Instruments) con 10 micras electrodos planos aislados de nitruro de titanio con nitruro de silicio. 60 electrodos están dispuestos en dos campos que consiste en una cuadrícula de 5x6 con el espaciamiento de centro a centro de 30 micras. (Otras configuraciones son posibles, los electrodos con una superficie de grabación de 10 micras de diámetro son mejores que los electrodos más grandes en términos de aislamiento de la actividad de neuronas individuales.)
2. Las señales eléctricas son amplificadas (amplificación de 1000x) con un amplificador de MEA 1060 (ALA Scientific Instruments). Las señales se adquieren a 10 kHz con una tarjeta de adquisición de datos (National Instruments) y software a la medida de adquisición de datos (también se puede comprar el software comercial).
3. El tejido se mantiene presionado en la MEA por una malla de nylon (53 micras), que se adjunta a una pieza de enganche personalizada que encaja perfectamente en el interior del anillo de tubo de cultivo de la MEA.

Parte 2. Instrumentación de entrega líquido

1. El tejido requiere superfusión continua, lo que nos garantiza mediante el suministro de solución de Ringer (115 de cloruro de sodio mM, 5 mM de cloruro de potasio, dos de cloruro de calcio mM, 2 de cloruro de magnesio mM, 25 de bicarbonato de sodio mM, HEPES 10 mM y 10 mM D-(+ )-glucosa) a partir de una bomba de HPLC. Los estímulos se presentan al realizar las inyecciones en una válvula de HPLC y el cambio entre flujo continuo y el lazo. Tanto la bomba de HPLC y la bomba de inyección de robot jeringas se suministran con solución de Ringer.
2. Solución de Ringer se mantiene en un baño de agua caliente (ISOTEMP 105) a 42 ° C durante todo el experimento y está continuamente burbujeado con 95% O ₂ / 5% CO _2. Un matraz separado de Ringer sin glucosa se prepara para hacer copias de la bomba de jeringa. Solución de Ringer se entrega a los tejidos utilizando una bomba de 307 HPLC (Gilson), a razón de 3 ml / min. En un experimento típico de 5-6 horas, 1 litro de solución de Ringer cada uno es suficiente.
3. A lo largo del experimento, el tejido es continua superfused con 37 ° C la solución de Ringer. Una sonda de calor se coloca directamente sobre el tejido.
4. Los estímulos se entregan con el líquido de Gilson 215 brazo controlador robótico. Los estímulos se guardan en frascos de vidrio con tapa de goma, y ​​bajo el control del software de Gilson, el brazo robótico de entrega de los estímulos a la línea de perfusión, mientras que el caudal y presión constantes se mantienen.
5. El estado de la válvula de HPLC (bucle comprometido / no comprometidos) está representada por una tensión eléctrica, que es registrado por el equipo de adquisición como un canal adicional para asegurar la sincronización con la actividad neuronal.

Parte 3. Preparación de los MEA y el dispositivo de entrega de estímulo

1. Antes de realizar la disección, llenar el MEA y con BSA en dH2O durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente.
2. Enjuague el MEA con calentamiento burbujea la solución de Ringer y el lugar de la MEA en el hielo.
3. El primer controlador de líquidos HPLC y la bomba de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Parte 4. VNO Disección

1. Antes de realizar la disección, llenar 2 60x15 mm placas de Petri con burbujas solución de Ringer y el lugar en el hielo. También llenar dos platos Petri Sylgard recubierto del mismo tamaño con solución de Ringer y el lugar en el hielo. Chill adicionales 50 ml de agua tibia-burbujas de timbre para su uso durante la disección.
2. El ratón se sacrifica por asfixia de CO ₂ seguido por dislocación cervical.
3. Hacer incisiones bilaterales desde el lado de la boca, que corre paralela a la línea de la mandíbula, en la parte posterior de la cabeza. Únete a los dos cortes a lo largo de la parte posterior del cuello y quitar la parte dorsal de la cabeza, dejando la mandíbula inferior, conectado al ratón.
4. Usando tijeras finas, cortadas entre el tejido y cada lado del hueso de la mandíbula superior para separar el tejido del hueso.
5. # 3 usando pinzas, retire el tejido del paladar para exponer la cavidad nasal.
6. Utilizando unas tijeras pequeñas o un bisturí, corte entre uno y otro lado de los dientes frontales superiores 2 para liberar la cápsula vomeronasal de los huesos.
7. # 3 usando pinzas, recoger la cápsula vomeronasal por el hueso plano y colocar en la placa de Petri en el hielo. Los pasos a través de la inmersión se debe realizar en menos de 3 minutos.
8. Coloque el plato en un estereomicroscopio, iluminado con la luz reflejada. Retire la cápsula ósea de un VNO a la vez usando # 3 pinzas. Utilice una mano para estabilizar la cápsula ósea sujetando el extremo caudal y la otra mano para pelar los huesos fuera de la VNO, teniendo cuidado de no dañar el VNO.
9. Cuando se retira el hueso, la transferencia del VNO a un plato de Petri recubiertas Sylgard. Utilice el plato que queda para el VNO otros. Interruptor de la iluminación de luz transmitida.
10. Utilizando micro-tijeras o pinzas de # 5, separar el VNO de los vasos sanguíneos reduciendo a lo largo del borde del VNO. En este punto, setiene la hoja neural completamente separados de los vasos sanguíneos.
11. Coloque el VNO con el lado interno (dendríticas). # 3 usando pinzas, anclar el VNO a la Sylgard en una esquina del tejido. Pelar el epitelio neural de la lámina basal con un pequeño fragmento de una hoja de afeitar con revestimiento de teflón celebró con una pinza. De la cuchilla en un ángulo pequeño (<30 ° de la superficie de la antena) es el mejor.
12. Con una pipeta de vidrio, la transferencia de la pieza del epitelio neural de la antena en el AMUMA. La posición del VNO en la parte superior del campo de electrodos con el lado dendríticas arriba. Retire el exceso de solución de Ringer con una pipeta. Coloque el soporte de tejido de malla en el pozo de la matriz para mantener el VNO en su lugar, y llenar con solución de Ringer frío es.

Parte 5. Grabación

1. Coloque el MEA en un MEA 1060 amplificador y la posición de la sonda de calor directamente sobre el tejido.
2. Para confirmar la correcta colocación de la sonda de calefacción, estimular con solución de Ringer conteniendo 50 mM de potasio (sustituido por sodio equimolar) durante 2 segundos. Ajuste la posición de reducir al mínimo la latencia de la respuesta neuronal a la solución de potasio.
3. Superfuse el tejido con una solución de Ringer se calienta durante 45 minutos a 1 hora antes de la grabación para que el tejido se adapte.
4. Las señales eléctricas se guardan en el disco utilizando el software de grabación personalizada.

Parte 6. Análisis de Datos

1. El análisis de datos en línea se puede hacer con las grabaciones de electrodos en bruto. Por ejemplo, podemos medir los cambios en la tasa de disparo de las células registradas en respuesta a ligandos particular. Los conjuntos de datos resultantes son grandes y se puede utilizar para hacer frente a muchas preguntas diferentes, la familiaridad con un lenguaje de programación o análisis (C, Matlab, R, Python, o similar) es necesaria.

Parte 7. Resultados representante

Esta preparación suele ser lo suficientemente estable para grabar durante 6 horas, produciendo una gran cantidad de datos (6 horas de grabación de 60 electrodos).

Figura 1. Una instantánea de la actividad simultánea a través de la mitad de la matriz se muestra. La ventana de tiempo se extiende por 400 ms. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.

Figura 2. En un experimento típico, nos estimulan con compuestos de interés en particular por 10 segundos. Este trazado, que es un ejemplo de una respuesta a 100 veces la orina diluida ratón hembra. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 2.

Discussion

Grabaciones multielectrodo conjunto nos permiten la posibilidad de monitorear la actividad simultánea de una gran población de neuronas. Esta es una herramienta útil para probar las propiedades de un sistema sensorial, en concreto el VNO. A diferencia del sistema olfatorio principal, el OVN detecta estímulos en fase líquida. Además, el VNO es un tejido heterogéneo. Hay aproximadamente 300 tipos diferentes de receptores en el ratón ^1, presumiblemente con perfiles de respuesta diferente. MEA grabaciones en combinación con el brazo robótico nos permite entregar de forma fiable los estímulos líquido a una población grande y diversa de las neuronas y la identidad de una respuesta electrofisiológica. Además, la estabilidad del VNO in vitro da tiempo para múltiples repeticiones de un estímulo.

Anteriormente, esta técnica se ha utilizado para investigar las propiedades sensoriales de VSNs en respuesta a la orina del ratón ^2, así como servir como un método seguro para la identificación de ligandos individuales presentes en la orina ^3. En el futuro, esta técnica puede ser muy útil para el descubrimiento y ligando más en la caracterización de las propiedades sensoriales del VNO.