Summary
هذا المقال يدل على وضعها الداخلي كيلوبايت DeOme
Abstract
توضح هذه المقالة ويقارن إزالة الدهون سادة الداخلي التي وضعها آخرون DeOme بن كيلو بايت. (1) وتجنيب الداخلي التي وضعها بن بريل وآخرون ب 2 ، يليها إجراء عملية زرع الثدي الظهارية. ويستخدم على نطاق واسع من قبل إجراء زراعة ثدي الأحياء الثديية لأنه يستفيد من حقيقة أن تطور هام للظهارة الثديية لا يحدث إلا بعد البلوغ. في 3 أسابيع من العمر ، وينحصر نمو شجرة الثدي الظهارية في محيط الحلمة وسادة خالية من الدهون إلى حد كبير من ظهارة الثديية ، ولكن بنسبة 7 أسابيع من عمر شجرة الظهارية الأقنية تمتد في جميع أنحاء منصة الدهون بأكمله. ولذلك ، إذا كان هذا جزء صغير من لوحة تحتوي على الدهون ظهارة ، تتم إزالة المنطقة الواقعة بين الحلمة والعقدة الليمفاوية ، في 3 أسابيع من العمر ، وسوف ظهارة الذاتية أبدا ملء الوسادة الثديية الدهون ، ويوصف لوحة الدهون بأنه "تطهير ". في هذا الوقت ، يمكن زرع الثدي ظهارة من مصدر آخر في لوحة الدهون تطهيرها حيث لديه القدرة على تمديد أشجار الأقنية الثديية من خلال الخروج من لوحة الدهون. وقد استخدم هذا الإجراء في نماذج تجريبية كثيرة بما في ذلك دراسة النمط الظاهري ورم في الأنسجة الطلائية ثديية معدلة وراثيا من دون آثار الخلط الجيني للحيوان كامل على 3 ، في التعرف على الخلايا الجذعية الثديية عن طريق زرع الخلايا في تخفيف محدود 4،5 ، وتحديد إذا العقيدات المفرطة التصنع المضي قدما لأورام الثدي 6 ، وتقييم تأثير هرمون قبل التعرض على سلوك ظهارة 7،8 الثديية.
ثلاثة فئران الاسبوع المضيف القديمة تخدير ، وتنظيفها وقيدا على مسرح العمليات الجراحية. يتم إجراء شق في منتصف السهمي من خلال الجلد ، ولكن ليس في الغشاء البريتوني ، وتمتد من العانة إلى القص يتم إجراء تخفيضات المائل عن طريق الجلد من شق منتصف السهمي عبر الحوض تجاه كل ساق. يتم سحبها بعيدا عن الجلد البريتوني لفضح 4 الغدة الثديية الأربية. مسح لوحة الدهون عن طريق إزالة الأنسجة الدهنية لوحة سابقة لالعقدة الليمفاوية. يتم زرع أجزاء ظهارة أو الخلايا الظهارية في لوحة المتبقية من الدهون التي تم تطهيرها وإغلاق الماوس.
Protocol
1. إعداد زرع الطلائية
يمكن زرعها الطازجة أو المجمدة الأنسجة الطلائية المانحة إلى منصة الدهون تطهيرها ، ولكن إعداد مسبق من الجهات المانحة ظهارة المجمدة هو أكثر ملاءمة مع انخفاض الحد الأدنى من الكفاءة في زرع (> كفاءة 85 ٪). بروتوكول لإعداد ظهارة المانحة المجمدة على النحو التالي :
قبل إعداد المانحة ظهارة زرع ، وإعداد وسائل الاعلام عن تجميد ظهارة وقسامة حول 1ml الى cryovials. ويمكن تخزين هذا في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر لحين الحاجة إليها. تجميد وسائل الاعلام وسائل الاعلام يتضمن DMEM/F12 مخزنة مع HEPES وNaHCO 3 ، 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، وثنائي ميثيل sulphoxide 10 ٪ (DMSO).
حصاد ظهارة الثديية من الماوس الأنثى الموت الرحيم في الآونة الأخيرة.
- غسل الفأر مع EtOH 70 ٪.
- اجراء خفض منتصف السهمي من خلال جدار الجسم تمتد من العانة إلى القص دون اختراق الأغشية المصلية من التجويف البطني الجسم. إجراء خفض المائل من شق الأولية في كل اتجاه العانة الساق الخلفية (الشكل 1).
- قشر جدار الجسم بعيدا عن الأغشية المصلية للكشف عن ال 5 الغدة الثديية الأربية التي تعلق على لفافة على الجانب السفلي من جدار الجسم. أفضل طريقة لتحقيق ذلك هي عن طريق استيعاب الأغشية المصلية بعناية مع الجزء المنحني من زوج من ملقط المنحني ، والحرص على عدم تخترق تجويف الجسم البطني. في نفس الوقت ، فهم على حافة قطع من إهاب مع ملقط مسنن مستقيم وسحب جدار الجسم بعيدا عن الأغشية المصلية.
- تحديد العقدة الليمفاوية في الغدة الثديية. تقع العقدة الليمفاوية عند تقاطع ثلاثة الأوعية الدموية بارزة في الغدة الثديية ، ويمكن أن يشعر بأنه العقيدات الكثيفة داخل لوحة الدهون (الشكل 2). مع غيض من مقص العين ، وارتشف من الأنسجة الدهنية المحيطة العقدة. مع إصبع الصدارة على الجانب البشرة من الجلد ، والضغط لرفع عقدة الخروج من لوحة الدهون وقرصة تشغيله مع زوج من ملقط منحنية. تجاهل العقدة الليمفاوية.
- في حين عقد على هامش الجلد ، فهم سادة الثديية الدهون مع الحافة المنحنية من زوج من ملقط المنحنية وقشر تدريجيا لوحة الدهون بعيدا عن جدار الجسم. اتبع اتجاه لوحة الدهون نحو السطح الظهري للفأرة أثناء إزالة الغدة الثديية بالكامل في قطعة واحدة.
- وضع الغدة الثديية على كتلة قطع بلاستيكية معقمة. إضافة كمية صغيرة من وسائل الإعلام ، نحو 200 ميكرولتر ، على سطح غدة لإبقائها رطبة. فرم الغدة الى قطع 1MM بشفرة حلاقة جديدة. تقسيم الغدة مفروم إلى أربعة أجزاء وتوزيعها بين أربعة وسائل الإعلام cryovials تجميد بالملقط. وضعت في الفريزر cryovials Nalgene السيد "خلية متجمد الذي 250ml من الكحول الآيزوبروبيل في المقصورة الخارجي. ضع الثلاجة في الفريزر Nalgene -70 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. مخزن القنينات المجمدة للأجزاء الثدي في النيتروجين السائل حتى اللازمة ل الزرع. وسيكون لكل cryovial تحتوي على أجزاء الغدة الثديية بما يكفي لزرع في منصات الدهون التي تم تطهيرها من الفئران المضيف 4-8.
2. إعداد زرع خلايا
وقد زرع مختبرنا أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك خلدت الثدي خطوط الخلايا الظهارية ، خطوط الخلايا الثديية أو ورم الخلايا الثديية الأولية إلى وسادة ماوس مسح الدهون. بروتوكول لإعداد الفاصلة - D لزرع الخلايا كما يلي :
- تستزرع فاصلة - D الخلايا في وسائل الإعلام العادية التي تحتوي على MECL DMEM : F12 تستكمل مع 2 ٪ الكبار المصل البقري (ABS) ، mEGF ، الانسولين ، مضاد حيوي / مضاد فطري (AB / ص).
- حصاد الفاصلة - D الخلايا عندما كانت الخلايا 85 ٪ -90 ٪ متموجة.
- الطرد المركزي تعليق خلية في 1200rpm لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام MECL الطازجة وضبط تركيز الخلية إلى 5 × 10 6 / مل.
لزرع الخلايا الثديية الأولية ، ويتم عزل الخلايا الظهارية الأولية من الغدد الثديية الماوس الثدي خلال ال 5 تفارق الميكانيكية والأنزيمية. ومعلق الخلايا في DMEM : وسائل الإعلام F12 وتعديلها لتركيز المطلوب ، وعادة 5 × 10 6 مل /.
3. المعيار الداخلي للمقاصة لوحة الماوس فات الثديية
- تخدير الثلاثة الماوس الاسبوع المضيف القديمة. حدد الفئران التي هي <12 ز لضمان ألا يكون قد بدأ النمو الأقنية الثديية. نستخدم 200mg/kg من وزن الجسم من ثلاثي بروم إيثانول ، 2،2،2.
- بعد الفأر هو تخدير ، وكبح جماح بحزم الماوس ، الجانب البطني مع الاطراف الممدودة ، على مسرح العمليات الجراحية في البطن بحيث يتم التهكم. قبل الجراحة ، ويدير المسكنات ، إما بوبيفاكايين (<1mg/kg) أو البوبرينورفين (0.05mg/kg) ، تحت الجلد.
- فهم الجلد بالملقط بضعة ملليمترات فوق الحوض ورفع الامر من البطن . ارتشف الجلد مع مقص ، واجراء خفض منتصف السهمي من خلال جدار الجسم تمتد من العانة إلى القص. لا يخترق الأغشية المصلية من تجويف الجسم البطني. لا تجعل شق الأولي قريبة جدا من مجرى البول بحيث مقاطع الجرح لن تتدخل مع قدرة الماوس ، للتبول.
- من شق الأولية ، وجعل التخفيضات المائل عن طريق الجلد من خط منتصف الحوض عبر كل منهما في اتجاه الساق الخلفية.
- استخدام المنطقة المنحنية المقوسة لملقط لفهم بلطف الأغشية المصلية. استخدام ملقط الأنسجة لفهم الهامش قطع من الجلد وسحب جدار الجسم بعيدا عن الأغشية المصلية وفضح الموافق 5 الغدة الثديية الأربية الموجود على لفافة على الجانب السفلي من جدار الجسم.
- يكوي الحلمة ، واثنين من عقدة الشرايين المؤدية إلى العقدة (الشكل 2)
- فصل الغدد الرابع والخامس. يكوي هامش الغدة الخامس لمنع نشوب من الغدة 6 عشر.
- تقسيم لوحة الدهون من الغدة الثديية الرابع عبر لوحة قطع مع مقص الدهون البطنية فقط (نحو الجانب الحلمة) من العقدة. استخدام ملقط منحنية لنتشبث الجزء البطني لوحة الدهون وتسحبه بعيدا عن جدار الجسم في قطعة واحدة. اضغط على بطني جزء من لوحة الدهون بين شريحتين وضعت في طبق زجاج تلوين الأنسجة التي تحتوي على مثبت في Carnoy. سيتم إصلاح هذا النسيج الملون والحل في وقت لاحق مع الشب القرمز للتحقق من مسح الهوامش (الشكل 3). تنظيف اللفافة في انحاء المنطقة من إزالة جزء من لوحة الدهون لإزالة كل أثر للغدة الثديية مع ملقط منحنية.
4. بديل "الإنقاذ الداخلي للمقاصة لوحة فات
بعد واحد أصبح المختصة للإجراءات موحدة لتبادل المعلومات على لوحة الماوس الدهون الثدي ، فإنها قد تفضل أن الإجراء محاولة تجنيب أقل الغازية التي طورتها بريل وآخرون (2008) 2.
- إعداد الماوس كما لإجراء القياسية.
- فهم الحلمة من الغدة الثديية fourth الأربية وخفض محيط 3-5 ملم دائرة حول الحلمة مع غيض من المقص.
- سحب الحلمة بعيدا عن الجسم لفصل جزء من قطع الجلد واستخلاص الرابع الغدة الثديية الأربية من خلال الثقب.
- تحديد العقدة. استخدام مكواة ليكوي العقدة والغدة الثديية ال 6 من خلال الثقب.
- قص وفصل الجزء الأكثر سطحية من الغدة الثديية 5 عشر قبل العقدة. تتم إزالة الحلمة ، منطقة دائرية من جلد وجزء من لوحة ظهارة تحتوي على الدهون الثدي في قطعة واحدة.
5. نسيج / زرع الخلايا
- لشظايا ظهارة زرع ، تذويب a cryovial من ظهارة ونقل إلى شظايا الظهارية طبق بتري تحتوي على وسائط الإعلام الجديدة لتخفيف خارج DMSO. جعل ثقب صغير في الجيب أو وسادة من الدهون مسح مع تلميح مقص للظهارة جديدة. وضع قطعة من 1MM ظهارة المانحة في جيب مع ملقط الإبرة. عقد جيب مغلقة مع ملقط الأنسجة كما كنت سحب الإبرة حتى ملقط النسيج لا يزال في مكانه.
- لزرع الخلايا ، وضخ خلايا 50000 في 10 ميكرولتر من وسائل الإعلام في كل لوحة من الدهون باستخدام حقنة هاميلتون 50μl مع إبرة قياس 22s.
6. إغلاق / إحياء ماوس
- ترتيب الجلد لاقفاله. فهم يعارضون هامش الجلد ، وتحميلهم معا بالملقط ، ورفع لهم بعيدا عن الأغشية المصلية من تجويف الجسم بطني وثيق مع مقاطع الجرح. عادة ، فمن الضروري استخدام اثنين من لقطات لإغلاق شق منتصف السهمي ومقطع واحد عن كل شق مائل للإجراءات القياسية. تجنب عرقلة مجرى البول. قد يكون من الضروري سد الثغرات في الجلد عند تقاطع للشقوق منتصف السهمي والمائل مع الخيط. وسوف يجنب هذا الإجراء لا يتطلب سوى مقطع واحد عن جرح كل جانب.
- . ضع الماوس في قفص لها والحفاظ على قفص تحت مصباح التدفئة حتى الماوس أحيا.
- يجب إزالة مقاطع الجرح بعد 2 أسابيع.
الشكل 1. عرض لنمط الشق.
الشكل 2. موقع العقدة الليمفاوية والأوعية الدموية والحلمة وظهارة الذاتية. يكوي في المواقع المشار إليها.
الشكل 3. يشن الجامعة يوضح أن يقتصر ظهارة الذاتية الى المنطقة ضمن دائرة ، وبالتالي الهوامش "واضحة".
7. ممثل النتائج
_r.jpg "بديل =" الشكل 4 "/>
الشكل 4. يشن الجامعة للسادة الدهون إزالة الماوس من 3 أسابيع من العمر تظهر هوامش تطهيرها.
الشكل 5. يشن الجامعة من ماوس الأسبوع 10 من العمر تظهر لوحة تطهيرها من الدهون الذاتية ظهارة الثديية.
الشكل 6. الهيماتوكسيلين ويوزين القسم الملون من سادة من الدهون تنظيفها من ماوس الأسبوع 10 من العمر.
الشكل 7. يشن الجامعة من ماوس الأسبوع 10 من العمر تظهر شجرة طبيعية الأقنية الثديية تطورت من ظهارة المزروعة.
الشكل 8. الهيماتوكسيلين ويوزين القسم الملون من القنوات الثديية تطورت من ظهارة المزروعة.
الرقم 9. الهيماتوكسيلين ويوزين القسم الملون من ورم الثدي المتقدمة من ظهارة المزروعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا التقرير ، نقدم طريقتين بديل لإزالة الدهون وسادة الماوس الثدي في التحضير لعمليات زرع الثدي الظهارية. وقد تم إجراء القياسية في استخدام تطورها منذ عام 1959 من قبل DeOme آخرون 1 بينما أكثر الغازية ، والأسلوب القياسي هو الأسلوب المفضل لتدريب المبتدئين لأن يتم عرضها بسهولة على بنية وتوجه الغدة الثديية. ومع ذلك ، قد يكون من المفضل إجراء تجنيب قبل أكثر خبرة الجراح بسبب العديد من المزايا 2. الأهم من ذلك الإجراء هو تجنيب أقل الغازية ، ويتطلب وقتا أقل ، ويمكن تنفيذها باستخدام فترة وجيزة من التخدير بالاستنشاق. هذا يقلل من فترة نقاهة عن الفأر. ويمكن أيضا إجراء تجنيب سيتم تنفيذه على الفئران الأصغر سنا (<21 يوما) ضمان التخليص الناجح للظهارة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك الحد من التصاق الأنسجة بعد الجراحة التي قد يكون من المفيد لو التجارب تتطلب جراحة لإزالة أورام تكرار الأولية ، وبعد السماح للمراقبة على المدى الطويل المستمر من الماوس لورم خبيث.
زرع جزء من الإجراء يستفيد من حقيقة أن التنمية الكاملة للغدة الثديية لا يحدث إلا بعد البلوغ. إزالة مسبقة من جزء صغير من لوحة الدهون التي تحتوي على ظهارة الذاتية "مسح" لوحة الدهون المتبقية من الفأرة الشباب ويقضي على إمكانات لتطوير أشجار الأقنية الظهارية. يمكن زرعها في ظهارة التجريبية لوحة الدهون تطهيرها من الماوس المضيفة وتقييم الامتداد الناتجة يمكن أن يتم من دون آثار الخلط من ظهارة المضيف الذاتية. ولذلك ، فإن هذا الإجراء مفيدا لتقييم قدرة الخلايا الظهارية لتطوير الثديية في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
- Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).
- Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).
- Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
- Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439, 993-997 (2006).
- Medina, D. Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer. Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).
- Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal. Development. 129, 1377-1386 (2002).
- Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice. Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).
