Summary
Dit artikel toont de procedure ontwikkeld door DeOme KB
Abstract
Dit artikel beschrijft en vergelijkt de dikke pad procedure voor de goedkeuring ontwikkeld door DeOme KB et al.. 1 en het spaarzaam procedure ontwikkeld door Brill B et al.. Twee, gevolgd door de borstklieren epitheliale transplantatie procedure. De borstklieren transplantatie procedure wordt veel gebruikt door mamma-biologen, omdat het profiteert van het feit dat de belangrijke ontwikkeling van de borstklier epitheel niet plaatsvinden tot na de puberteit. Op leeftijd van 3 weken, is de groei van de borstklier epitheliale boom beperkt tot de omgeving van de tepel en het vet pad is grotendeels verstoken van mamma-epitheel, maar door 7 weken oud zijn de epitheliale ductaal boom strekt zich de hele dikke pad. Daarom, als dit kleine gedeelte van het vet pad met epitheel, het gebied tussen de tepel en de lymfeklieren, verwijderd wordt op 3 weken oud zijn, zal de endogene epitheel nooit bevolken het uiervet pad en het vet pad wordt beschreven als "gewist ". Op dit moment kan mamma-epitheel uit een andere bron worden getransplanteerd in de gewist vet pad waar het de potentie heeft om mammae ductaal bomen uit te breiden door uit het vet pad. Deze procedure is gebruikt in veel experimentele modellen, inclusief het onderzoek tumor fenotype in transgene borstklieren epitheelweefsel zonder de verstorende effecten van het genotype op de gehele dier drie, in de identificatie van de mamma-stamcellen door het transplanteren van cellen in beperkte verwatering 4,5, het bepalen van Als hyperplastische knobbeltjes overgaan tot mammatumoren 6, en het effect van voorafgaande hormoon blootstelling op het gedrag van de borstklier epitheel 7,8 beoordelen.
Drie week oude host muizen zijn verdoofd, schoongemaakt en vastgebonden op een chirurgische podium. Een mid-sagittale incisie wordt gemaakt door de huid, maar niet het buikvlies, dat zich uitstrekt van het schaambeen tot het borstbeen. Schuine sneden worden gemaakt door de huid van het midden van de sagittale incisie in het bekken in de richting van elk been. De huid is verwijderd van het buikvlies getrokken naar de 4e lies borstklier bloot te leggen. Het vet pad wordt gewist door het verwijderen van het vet pad weefsel juist voor de lymfeklier. Epitheel fragmenten of epitheelcellen worden getransplanteerd in de resterende gewist vet pad en de muis is gesloten.
Protocol
1. Voorbereiding van de Transplant epitheel
Vers of bevroren donor epitheelweefsel kan worden getransplanteerd in de gewist dikke pad, maar vóór de voorbereiding van bevroren donor epitheel is het handiger met een minimale afname van de transplantatie efficiëntie (> 85% rendement). Het protocol voor de bereiding van bevroren donor epitheel is als volgt:
Alvorens donor transplantatie epitheel, voor te bereiden bevriezen media voor epitheel en aliquot ongeveer 1 ml in cryovials. Dit kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 6 maanden totdat het nodig is. Freeze media bevat DMEM/F12 media gebufferd met HEPES en NaHCO 3, 10% foetaal bovine serum (FBS) en 10% dimethylsulfoxide (DMSO).
Oogst borstklieren epitheel van een recent inslapen vrouwelijke muis.
- Was de muis met 70% EtOH.
- Maak een mid-sagittale gesneden door het lichaam muur zich uitstrekt van het schaambeen tot het borstbeen, zonder piercing de sereuze membranen van de ventrale lichaamsholte. Maak een schuin afgesneden van de eerste incisie aan het schaambeen naar elkaar achterbeen (figuur 1).
- Schil het lichaam muur weg van de sereuze membranen om de 5 e inguinale borstklier aan de fascia aan de onderkant van het lichaam muur bloot te leggen. De beste manier om dit te bereiken is door het grijpen van de sereuze membranen zorgvuldig met het gebogen gedeelte van een paar gebogen tang, en let niet te doorboren het ventrale lichaamsholte. Tegelijkertijd grijpen de snijrand van het integument met rechte gekarteld pincet en trek het lichaam muur weg van de sereuze membranen.
- Identificeer de lymfeklieren in de borstklier. De lymfeklier is gelegen op het kruispunt van drie prominente bloedvaten in de borstklier en kan worden gevoeld als een dichte knobbeltje in het vet pad (figuur 2). Met de punt van een paar ogen schaar, nip het vetweefsel rond het knooppunt. Met een wijsvinger op de epidermale kant van de huid, druk op de knoop uit het vet pad te verhogen en knijp het af met een paar van gebogen tang. Gooi de lymfeklieren.
- Terwijl de marges van de huid, pakt u de uiervet pad met de gebogen rand van een paar gebogen pincet en geleidelijk schil de dikke pad uit de buurt van het lichaam muur. Volg de richting van het vet pad naar het dorsale oppervlak van de muis als je de hele borstklier verwijderd in een stuk.
- Zet de borstklier op een steriele plastic snijden blokkeren. Voeg een kleine hoeveelheid van de media, ongeveer 200 ul, aan het oppervlak van de klier om het vochtig te houden. Hak de klier in 1mm stukken met een frisse scheermesje. Verdeel het gehakt klier in vier delen en verdelen onder de vier cryovials van media te bevriezen met een pincet. Doe de cryovials in een Nalgene "Mr Frosty cel vriezer, die 250 ml isopropylalcohol heeft in de buitenste compartiment. Doe de Nalgene vriezer in een -70 ° C vriezer voor 24 uur. Store bevroren flacons van mamma-fragmenten in vloeibare stikstof tot die nodig zijn voor transplantatie. Elke cryovial bevat genoeg borstklier fragmenten te verplanten in de vrijgemaakt vetkussentjes van 4 tot 8 gastheer muizen.
2. Voorbereiding van de Transplant cellen
Ons laboratorium heeft getransplanteerd verschillende celtypes, waaronder onsterfelijk mamma-epitheliale cellijnen, mammatumor cellijnen of primaire borstklieren cellen in een muis gewist dikke pad. Het protocol voor de bereiding van Comma-D-cellen voor transplantatie is als volgt:
- Comma-D cellen worden gekweekt in de reguliere media die MECL DMEM: F12 aangevuld met 2% Volwassene Bovine Serum (ABS), mEGF, insuline, antibiotica / Antimycoticum (AB / AM).
- Oogst Comma-D-cellen wanneer de cellen zijn 85% -90% confluent.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 1200 gedurende 5 minuten om pellet de cellen. Resuspendeer de cellen in verse MECL media en pas de cel concentratie 5 x 10 6 / ml.
Voor de transplantatie van primaire mamma-cellen, zijn de primaire borstklieren epitheliale cellen geïsoleerd uit muizen 5 e borstklieren door middel van mechanische en enzymatische dissociatie. Cellen worden geresuspendeerd in DMEM: F12 media en aangepast aan de gewenste concentratie, meestal 5 x 10 6 / ml.
3. Standaard procedure voor de goedkeuring van de Muis uiervet Pad
- Verdoven van de drie weken oude host muis. Selecteer de muizen die <12 g om ervoor te zorgen dat de borstklier ductaal groei niet is gestart. We maken gebruik van 200mg/kg van het lichaamsgewicht van de 2,2,2-tribroomethanol.
- Nadat de muis is verdoofd, stevig bedwingen van de muis, ventrale zijde met ledematen uitgestrekt, op een chirurgische het podium, zodat de buik is taunt. Voorafgaand aan de operatie, beheren analgetica, hetzij bupivacaïne (<1mg/kg) of buprenorfine (0.05mg/kg), subcutaan.
- Pak de huid met een tang een paar millimeter boven het bekken en til deze omhoog uit de buik . Nip van de huid met een schaar en een mid-sagittale snede te maken door het lichaam muur zich uitstrekt van het schaambeen tot het borstbeen. Niet doorboren de sereuze membranen van de ventrale lichaamsholte. Maak je eerste incisie te dicht bij de urinebuis, zodat wond clips niet interfereren met het vermogen van de muis om te urineren.
- Vanaf de eerste incisie, maken schuine sneden door de huid van het midden van de lijn over het bekken ten opzichte van elkaar achterbeen.
- Gebruik de gebogen gedeelte van de gebogen pincet voorzichtig pak de sereuze membranen. Gebruik weefsel tang om de cut marge van de huid te begrijpen en het lichaam muur weg te trekken van de sereuze membranen en bloot de 5 e inguinale melkklieren bevindt zich op de fascia aan de onderkant van het lichaam muur.
- Cauterize de tepel, knoop en twee slagaders die naar de knoop (figuur 2)
- Scheid de vierde en vijfde klieren. Cauterize de marge van de vijfde klier om ingroei te voorkomen dat de 6 e klier.
- Verdeel het vet pad van de vierde borstklier door te snijden in het vet pad met een schaar slechts ventrale (zijde naar tepel) van het knooppunt. Gebruik gebogen tang stevig vastpakken het ventrale deel van het vet pad en trek weg van het lichaam muur in een stuk. Druk op de ventrale deel van de dikke pad tussen twee dia's en in een glazen schaaltje met histologie vlekken Carnoy's fixeermiddel. Dit weefsel zal worden vastgesteld en later gekleurd met karmijn aluin oplossing om te controleren of gewist marges (figuur 3). Maak de fascia in de regio van het verwijderde deel van het vet pad om alle sporen van de borstklier verwijderen met de gebogen tang.
4. Alternatief "Sparing Procedure voor Clearing the Fat Pad
Na een is geworden bevoegde met de standaard procedure voor de goedkeuring van de muis uiervet pad, kunnen zij de voorkeur aan de minder invasieve sparen procedure ontwikkeld door Brill et al.. (2008) 2 poging.
- Bereid de muis als voor de standaard procedure.
- Pak de tepel van de vierde inguinale borstklier en snijd een 3-5 mm omtrek cirkel rond de tepel met de punt van een schaar.
- Trek de tepel uit de buurt van het lichaam naar het snijden gedeelte van de huid los te maken en de vierde inguinale borstklier trekken uit door het gat.
- Identificeer de node. Gebruik de cauterisatie naar het knooppunt en de 6 e borstklier door het gat cauterize.
- Knip en verwijder de meest oppervlakkige deel van de 5 e melkklier net voor het knooppunt. De tepel, cirkelvormig gebied van de huid en deel van de uiervet pad met epitheel worden verwijderd in een stuk.
5. Weefsel / Cell Transplantation
- Voor het transplanteren van epitheel fragmenten, ontdooien een cryovial van epitheel en de epitheliale fragmenten naar een petrischaal met vers medium te verdunnen de DMSO overdracht. Maak een klein gat of zak in de gewist vette pad met een schaar tip voor de nieuwe epitheel. Leg een stukje van 1mm donor epitheel in de zak met naald tang. Houd de zak gesloten met tissue tang als je de naald tang, zodat het weefsel blijft op zijn plaats.
- Voor het transplanteren van cellen, injecteren 50.000 cellen in 10 ul van media in elk vet pad met behulp van een 50μl Hamilton injectiespuit met een 22s naald.
6. Sluiting / Revival van de muis
- Schik de huid voor het sluiten. Pak tegen de marges van de huid, houdt ze samen met een pincet, til ze uit de buurt van de sereuze membranen van de ventrale lichaamsholte en sluit af met wond clips. Typisch, is het noodzakelijk om twee clips te gebruiken om het midden van de sagittale incisie en een clip voor elke schuine incisie voor de standaard procedure af te sluiten. Vermijd het belemmeren van de plasbuis. Het kan nodig zijn om hiaten in de huid op de kruising van de mid-sagittale en schuine insnijdingen met een hechtdraad. Het spaarzaam procedure zal vereisen slechts een wonde clip voor elke kant.
- . Plaats de muis in haar kooi en houd de kooi onder een warmtelamp totdat de muis is nieuw leven ingeblazen.
- De wond clips moeten worden verwijderd na 2 weken.
Figuur 1. Demonstratie van de incisie patroon.
Figuur 2. Locatie van de lymfeklieren, bloedvaten, tepel en endogene epitheel. Cauterize op locaties aangegeven.
Figuur 3. Whole mount laat zien dat endogeen epitheel is beperkt tot het gebied binnen de cirkel en dus de marges zijn 'duidelijk'.
7. Representatieve resultaten
_r.jpg "alt =" Figuur 4 "/>
Figuur 4. Whole mount van de verwijderde vet pad van 3 week oude muis zien gewist marges.
Figuur 5. Whole mount van een 10 week oude muis met dikke pad vrijgemaakt van endogene mamma-epitheel.
Figuur 6. Hematoxyline en eosine gekleurde deel van een geklaard vet pad van een 10 weken oude muis.
Figuur 7. Whole mount van een 10 week oude muis met normaal door de melkklieren ductaal boom ontwikkeld op basis van getransplanteerde epitheel.
Figuur 8. Hematoxyline en eosine gekleurde deel van mamma-kanalen ontwikkeld op basis van getransplanteerde epitheel.
Figuur 9. Hematoxyline en eosine gekleurde deel van een mammatumor ontwikkeld op basis van getransplanteerde epitheel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit rapport presenteren we twee alternatieve methodes voor het opruimen van de muis uiervet pad ter voorbereiding van mamma-epitheel transplantaties. De standaard procedure is in gebruik sinds zijn ontwikkeling in 1959 door DeOme et al.. 1 Terwijl meer invasieve, de standaard methode is de beste methode voor de opleiding van beginnende omdat de structuur en de oriëntatie van de borstklier gemakkelijk bekeken worden. Echter, de sparing procedure de voorkeur van de meer ervaren chirurg als gevolg van een aantal voordelen 2. Het belangrijkste is dat het sparen procedure is minder invasief, vereist minder tijd en kan worden uitgevoerd met behulp van een korte periode van inhalatie-anesthesie. Dit vermindert de herstelperiode voor de muis. De sparing procedure kan ook worden uitgevoerd op jonge muizen (<21 dagen) een geslaagde klaring van epitheel. Daarnaast is er een afname van weefsel hechting na de operatie, die kan voordelig zijn als experimenten nodig te herhalen operatie om primaire tumoren te verwijderen, maar voor de lange termijn voortdurende observatie van de muis voor de metastase mogelijk te maken.
De transplantatie gedeelte van de procedure maakt gebruik van het feit dat de volledige ontwikkeling van de borstklier niet plaatsvinden tot na de puberteit. Voorafgaande verwijdering van de klein gedeelte van het vet pad met de endogene epitheel "wist" het achtergebleven vet pad van de jonge muis en elimineert het potentieel voor de ontwikkeling van epitheliale ductaal bomen. Experimentele epitheel kan worden getransplanteerd in de vrijgemaakt vet pad van de host-muis en de beoordeling van de daaruit voortvloeiende uitwassen kan worden gemaakt zonder de verstorende effecten van de endogene gastheer epitheel. Daarom is deze procedure is handig voor de beoordeling van de capaciteit van de mamma-epitheliale cellen te ontwikkelen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
- Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).
- Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).
- Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
- Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439, 993-997 (2006).
- Medina, D. Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer. Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).
- Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal. Development. 129, 1377-1386 (2002).
- Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice. Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).
