Mammaires épithéliales procédure de greffe

Summary

Cet article montre la procédure développée par RomanDing KB

Abstract

Cet article décrit et compare la procédure de dédouanement coussinet adipeux développé par RomanDing Ko et al. ¹ et la procédure en épargnant développé par Brill B et al. ^2, suivie par la procédure de greffe épithéliales mammaires. La procédure de greffe mammaire est largement utilisée par les biologistes mammaires car il faut profiter du fait que le développement significatif de l'épithélium mammaire ne se produisent qu'après la puberté. A 3 semaines d'âge, la croissance de l'arbre épithéliales mammaires est confinée à la proximité de la tétine et le coussinet adipeux est largement dépourvue d'épithélium mammaire, mais par sept semaines d'âge de l'arbre canalaire s'étend à travers l'épithélium du pavé toute la graisse. Par conséquent, si cette petite portion du coussinet adipeux contenant l'épithélium, la région entre le mamelon et le ganglion lymphatique, est enlevé à 3 semaines d'âge, l'épithélium endogènes ne sera jamais remplir le pad mammaires graisse et le coussinet adipeux est décrit comme «effacé ». A cette époque, l'épithélium mammaire d'une autre source peut être transplantées dans le coussin effacé graisse où il a le potentiel pour étendre mammaires canalaires arbres à travers le coussinet adipeux. Cette procédure a été utilisée dans de nombreux modèles expérimentaux, y compris l'examen de phénotype tumoral dans le tissu épithélial mammaire transgéniques sans effets confondants du génotype sur l'animal entier ^3, dans l'identification des cellules souches mammaires en transplantant des cellules à une dilution limitée ^{de 4,5,} la détermination Si nodules hyperplasiques procéder à des tumeurs mammaires ^6, et d'évaluer l'effet de l'exposition aux hormones sur le comportement antérieur de l'épithélium mammaire ^7,8.

Trois souris semaine ancien hôte sont anesthésiés, nettoyés et sobre sur un stade chirurgical. Une incision médiane sagittale est faite à travers la peau, mais pas le péritoine, qui s'étend du pubis au sternum. Coupes obliques sont faites à travers la peau de l'incision médiane sagittale à travers le bassin vers chaque jambe. La peau est arrachée de le péritoine pour exposer la 4e glandes mammaires inguinales. Le coussinet adipeux est effacé en supprimant la partie antérieure du coussinet adipeux du tissu à l'envahissement ganglionnaire. Fragments épithélium ou des cellules épithéliales sont transplantées dans le coussin reste graisses effacé et la souris est fermé.

Protocol

1. Préparation de l'épithélium Transplant

Tissu du donneur frais ou congelés épithéliales peuvent être transplantées dans le coussin effacé la graisse, mais une préparation préalable de l'épithélium des bailleurs de fonds gelés est plus pratique avec une diminution minimale de l'efficacité de la transplantation (efficacité> 85%). Le protocole pour la préparation de l'épithélium des bailleurs de fonds gelés est comme suit:

Avant de préparer l'épithélium greffe des donateurs, des médias congeler pour préparer l'épithélium et aliquot environ 1 ml dans des cryotubes. Cela peut être conservé à 4 ° C pour un maximum de 6 mois jusqu'à ce que nécessaire. Gel des médias contient DMEM/F12 médias tamponnée avec HEPES et NaHCO _3, 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO).

Récolte épithélium mammaire d'une souris récemment euthanasiés femelle.

1. Laver la souris avec de l'EtOH 70%.
2. Faites une coupe mi-sagittale à travers la paroi du corps s'étendant du pubis au sternum sans percer la membrane séreuse de la cavité ventrale du corps. Faire une coupe oblique de l'incision initiale au niveau du pubis vers chaque patte postérieure (Figure 1).
3. Peler la paroi du corps loin de la membranes séreuses pour exposer le 5 ^ème glandes mammaires inguinales attaché à la planche de bord sur le dessous de la paroi du corps. La meilleure façon d'y parvenir est en saisissant les membranes séreuses avec soin la partie incurvée d'une paire de pinces courbes, en faisant attention à ne pas percer la cavité ventrale du corps. Simultanément, saisissez le bord coupé du tégument avec une pince dentée droite et tirez la paroi du corps loin de la membranes séreuses.
4. Identifier les ganglions lymphatiques dans la glande mammaire. Le ganglion est situé à l'intersection de trois vaisseaux sanguins de premier plan dans la glande mammaire et peut être ressenti comme un nodule dense dans le coussinet adipeux (figure 2). Avec la pointe d'une paire de ciseaux des yeux, étouffer le tissu adipeux entourant le nœud. Avec un doigt avant sur le côté épidermique de la peau, appliquer une pression pour élever le noeud hors du coussinet adipeux et pincez avec une paire de pinces courbes. Jeter les ganglions lymphatiques.
5. Tout en maintenant les marges de la peau, saisir le pad mammaires graisse avec le bord incurvé d'une paire de pinces courbes et progressivement éplucher les coussinet adipeux loin de la paroi du corps. Suivre la direction du coussinet adipeux vers la surface dorsale de la souris comme vous enlever la glande mammaire de toute une pièce.
6. Mettez la glande mammaire sur un bloc de coupe en plastique stérile. Ajouter une petite quantité de médias, à environ 200 pi, à la surface de la glande pour le garder humide. Hacher la glande en morceaux 1mm avec une lame de rasoir propre. Divisez la glande hachée en quatre portions et distribuer entre quatre cryotubes des médias gel avec une pince. Mettez les cryotubes dans un Nalgene "congélateur M. cellules Frosty qui a 250ml d'alcool isopropylique dans le compartiment externe. Mettez au congélateur Nalgene dans un congélateur à -70 ° C pendant 24 heures. Conserver les flacons congelés de fragments mammaires dans l'azote liquide jusqu'à requis pour transplantation. Chaque cryovial va contenir des fragments de glande mammaire de suffisamment de transplanter dans les coussinets effacé la graisse de 4 à 8 souris hôte.

2. Préparation des cellules Transplant

Notre laboratoire a transplanté différents types de cellules, y compris immortalisé lignées de cellules épithéliales mammaires, des lignées cellulaires tumorales mammaires ou des cellules primaires mammaires de souris dans un coussinet adipeux effacé. Le protocole pour la préparation des virgules D cellules pour la transplantation est la suivante:

1. Comma-D cellules sont cultivées dans les médias réguliers MECL contenant du DMEM: F12 supplémenté avec 2% de sérum bovin adulte (ABS), mEGF, insuline, antibiotique / antimycotique (AB / AM).
2. Récolte Comma-D cellules lorsque les cellules sont confluentes à 85% -90%.
3. Centrifuger la suspension cellulaire à 1200rpm pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules. Resuspendre les cellules dans l'eau douce des médias MECL et ajuster la concentration de cellules de 5 x 10 ⁶ / ml.

Pour la transplantation de cellules primaires mammaires, les cellules épithéliales mammaires primaires sont isolés de souris 5 ^ème glandes mammaires par dissociation mécanique et enzymatique. Les cellules sont remises en suspension dans du DMEM: F12 et des médias ajusté à la concentration désirée, généralement de 5 x 10 ⁶ / ml.

3. Procédure standard pour la compensation de la glande mammaire de souris Fat

1. Anesthésier la souris trois semaines vieil hôte. Sélectionnez les souris qui sont <12 g pour s'assurer que la croissance mammaires canalaires n'a pas été initié. Nous utilisons 200mg/kg de poids corporel de 2,2,2-tribromoéthanol.
2. Après la souris est anesthésiée, fermement empêcher la souris, la face ventrale avec des membres tendus, sur une scène chirurgicale afin que l'abdomen est narguer. Avant la chirurgie, d'administrer des analgésiques; soit bupivacaïne (1mg/kg <) ou buprénorphine (0.05mg/kg), sous-cutanée.
3. Saisir la peau avec une pince de quelques millimètres au-dessus du bassin et le soulever de l'abdomen . Nip la peau avec des ciseaux et de faire une coupe mi-sagittale à travers la paroi du corps s'étendant du pubis au sternum. Ne pas percer les membranes séreuses de la cavité ventrale du corps. Ne faites pas votre incision initiale trop proche de l'urètre afin que les clips blessure ne sera pas interférer avec la capacité de la souris pour uriner.
4. De l'incision initiale, faire des coupes obliques à travers la peau de la mi-ligne à travers le bassin vers chaque patte postérieure.
5. Utilisez la zone incurvée de la pince incurvée pour saisir délicatement les membranes séreuses. Utilisez une pince pour saisir les tissus de la marge de coupe de la peau et tirez la paroi du corps loin de la membranes séreuses et d'exposer la 5 ^ème glandes mammaires inguinales situées sur la façade sur le dessous de la paroi du corps.
6. Cautériser le mamelon, noeud et deux artères menant au nœud (figure 2)
7. Séparer les glandes quatrième et cinquième. Cautériser la marge de la glande cinquième à éviter interposition de la glande 6 ^ème.
8. Divisez le coussinet adipeux de la glande mammaire par quatrième coupant le coussinet adipeux avec des ciseaux juste ventrale (côté vers mamelon) du noeud. Utilisez une pince incurvée de saisir fermement la partie ventrale du coussinet adipeux et il se détache de la paroi du corps en un seul morceau. Appuyez sur la partie ventrale du coussinet adipeux entre deux diapositives et mettre dans un plat en verre coloration histologique contenant fixateur de Carnoy. Ce tissu sera fixé et coloré plus tard avec solution d'alun de carmin pour vérifier les marges effacé (figure 3). Nettoyez le fascia autour de la région de la partie enlevée du coussinet adipeux pour éliminer toute trace de la glande mammaire avec la pince courbe.

4. Alternative "Procédure Sparing pour la compensation du coussinet adipeux

Après une est devenue compétente avec la procédure standard pour la compensation du tapis de souris mammaires graisses, ils peuvent préférer tenter la procédure en épargnant moins invasif développé par Brill et al. (2008) ^2.

1. Préparer la souris comme pour la procédure standard.
2. Saisir le mamelon de la glande mammaire de quatrième inguinale et découpez un cercle 3-5 mm circonférence autour du mamelon avec la pointe de ciseaux.
3. Tirez la tétine loin du corps pour détacher la partie découpée de la peau et tirer le quatrième glande mammaires inguinales par le trou.
4. Identifier le nœud. Utilisez la cautérisation cautériser le noeud et la glande mammaire de 6 ^ème à travers le trou.
5. Couper et détacher la partie la plus superficielle de la glande mammaire de 5 ^ème, juste avant le nœud. Le mamelon, zone circulaire de la peau et une partie de l'épithélium coussinet adipeux mammaires contenant sont retirés en une seule pièce.

5. Tissu / transplantation de cellules

1. Pour les fragments épithélium transplantation, décongeler un cryovial de l'épithélium et le transfert des fragments épithéliaux d'une boîte de Petri contenant un milieu frais pour diluer le DMSO. Faire un petit trou ou une poche dans le pad effacé la graisse avec la pointe de ciseaux pour le nouvel épithélium. Mettre un morceau de 1 mm de l'épithélium des bailleurs de fonds dans la poche avec une pince aiguille. Tenir la poche fermée avec une pince le tissu que vous retirer l'aiguille de sorte pince le tissu reste en place.
2. Pour les cellules du repiquage, d'injecter 50 000 cellules dans 10 ul de médias dans chaque coussinet adipeux aide d'une seringue 50 pl Hamilton avec une aiguille de calibre 22s.

6. Fermeture / Relance de la souris

1. Disposer de la peau pour la fermeture. Saisir opposés marges de la peau, les maintenir ensemble avec des pinces, les soulever loin de la membranes séreuses de la cavité ventrale du corps et fermer avec des clips plaie. Typiquement, il est nécessaire d'utiliser deux clips pour fermer l'incision sagittal et un clip pour chaque incision oblique pour la procédure standard. Evitez d'obstruer l'urètre. Il peut être nécessaire pour combler les lacunes dans la peau à l'intersection des incisions mi-sagittal et oblique, avec une suture. La procédure en épargnant ne nécessiteront un clip blessure pour chaque côté.
2. . Placez la souris dans sa cage et garder la cage sous une lampe chauffante jusqu'à ce que la souris a relancé.
3. Les clips plaie doit être retiré après 2 semaines.

Figure 1. Démonstration du modèle de l'incision.

Figure 2. Situation des ganglions lymphatiques, les vaisseaux sanguins, le mamelon et l'épithélium endogène. Cauterize aux endroits indiqués.

Montez la figure 3. Entier démontre que l'épithélium endogène est limité à la zone dans le cercle et donc les marges sont "clairs".

7. Les résultats représentatifs

_r.jpg "alt =" Figure 4 "/>
Figure 4. Monter entiers de coussinet adipeux retirés de souris à 3 semaines anciennes montrant des marges effacés.

Figure 5. Monture entier d'une souris 10 semaines anciennes montrant coussinet adipeux débarrassé de l'épithélium mammaire endogène.

Figure 6. Hématoxyline et l'éosine la section teinté d'un tampon effacé la graisse d'une souris 10 semaines vieux.

Figure 7. Mont entier d'une souris 10 semaines anciennes montrant normale arbres mammaires canalaires développé à partir de l'épithélium transplanté.

Figure 8. Hématoxyline et l'éosine la section des conduits mammaires teinté développé à partir de l'épithélium transplanté.

La section Figure 9. Hématoxyline et l'éosine teinté d'une tumeur mammaire développé à partir de l'épithélium transplanté.

Discussion

Dans ce rapport, nous présentons deux méthodes alternatives pour dégager le tapis de souris mammaires de graisse dans la préparation de greffes mammaires épithéliales. La procédure standard a été en usage depuis son élaboration en 1959 par RomanDing et al. ¹ Bien plus invasives, la méthode standard est la méthode préférée pour la formation des novices, car la structure et l'orientation de la glande mammaire sont facilement visualisés. Toutefois, la procédure en épargnant peut être préférée par le chirurgien plus expérimenté en raison de plusieurs avantages ^2. Surtout, la procédure est moins invasive en épargnant, nécessite moins de temps et peut être effectuée en utilisant une brève période d'anesthésie par inhalation. Cela réduit la période de récupération pour la souris. La procédure en épargnant peut également être effectuée sur de jeunes souris (<21 jours) pour obtenir l'autorisation de succès de l'épithélium. De plus, il ya une réduction de l'adhérence des tissus après une intervention chirurgicale qui peut être avantageux si des expériences répétées nécessitent une intervention chirurgicale pour retirer des tumeurs primaires, tout en permettant à la poursuite à long terme d'observation de la souris pour les métastases.

La partie de la procédure de greffe prend avantage du fait que le développement complet de la glande mammaire n'a pas lieu qu'après la puberté. Avant l'enlèvement de la petite portion du coussinet adipeux contenant l'épithélium endogène "efface" le pad graisseuses restantes de la souris jeunes et élimine le potentiel pour le développement de l'épithélium canalaire arbres. L'épithélium expérimentaux peuvent être transplantées dans le coussin effacé la graisse de la souris hôte et l'évaluation des excroissances qui en résulte peut être faite sans les effets confondants de l'épithélium hôte endogène. Par conséquent, cette procédure est utile pour évaluer la capacité des cellules épithéliales mammaires pour développer in vivo.