Summary
यह आलेख DeOme KB द्वारा विकसित की प्रक्रिया को दर्शाता है
Protocol
1. प्रत्यारोपण उपकला तैयार
ताजा या फ्रोजन दाता उपकला ऊतक को मंजूरी दे दी वसा पैड में प्रत्यारोपित किया जा सकता है, लेकिन जमे हुए दाता उपकला की पूर्व तैयारी प्रत्यारोपण दक्षता में न्यूनतम कमी (> 85% दक्षता) के साथ और अधिक सुविधाजनक है. जमे हुए दाता उपकला की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल निम्नानुसार है:
दाता प्रत्यारोपण उपकला की तैयारी से पहले, उपकला और cryovials में 1ml के बारे में विभाज्य के लिए फ्रीज मीडिया को तैयार हैं. यह 4 ° C में संग्रहीत किया जा सकता है 6 महीने के लिए जब तक जरूरत है. रुक मीडिया DMEM/F12 HEPES और 3 NaHCO, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 10% डाइमिथाइल sulphoxide (DMSO) के साथ buffered मीडिया शामिल हैं .
एक हाल ही में euthanized महिला माउस से स्तन उपकला हार्वेस्ट.
- 70% EtOH के साथ माउस धो लें.
- उदर शरीर गुहा के तरल झिल्ली भेदी के बिना शरीर pubis से उरोस्थि के लिए विस्तार की दीवार के माध्यम से एक मध्य बाण के समान कटौती करें. (चित्रा 1) प्रत्येक हिंद पैर की ओर pubis पर प्रारंभिक चीरा से एक परोक्ष कटौती करें.
- शरीर तरल करने के लिए 5 वें वंक्षण स्तन शरीर दीवार के नीचे पर प्रावरणी से जुड़ी ग्रंथि बेनकाब झिल्ली से दूर दीवार पील. तरल झिल्ली घुमावदार घुमावदार संदंश की एक जोड़ी के हिस्से के साथ सावधानी लोभी द्वारा इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है, नहीं वेंट्रल शरीर गुहा बेध करने के लिए सावधान किया जा रहा है. इसके साथ ही, सीधे दाँतेदार संदंश के साथ आवरण के कट बढ़त समझ और शरीर दीवार तरल झिल्ली से दूर खींच.
- स्तन ग्रंथि के भीतर लसीका नोड को पहचानें. लसीका नोड स्तन ग्रंथि में तीन प्रमुख रक्त वाहिकाओं के चौराहे पर स्थित है और वसा पैड (चित्रा 2) के भीतर एक घने गुत्थी के रूप में महसूस किया जा सकता है. आँख कैंची, चुटकी वसा नोड आसपास के ऊतकों की एक जोड़ी के टिप के साथ. त्वचा के epidermal तरफ सामने उंगली के साथ, वसा पैड के बाहर नोड को बढ़ाने के लिए और यह घुमावदार संदंश की एक जोड़ी के साथ बंद चुटकी दबाव लागू होते हैं. लसीका नोड त्यागें.
- जबकि त्वचा के हाशिये पकड़े, घुमावदार संदंश की एक जोड़ी के घुमावदार बढ़त के साथ और धीरे धीरे शरीर की दीवार से दूर वसा पैड छील स्तन वसा पैड समझ. माउस के रूप में आप एक टुकड़ा में पूरे स्तन ग्रंथि को निकालने के पृष्ठीय सतह की ओर वसा पैड की दिशा का पालन करें.
- एक बाँझ प्लास्टिक काटने ब्लॉक स्तन ग्रंथि पर रखो. मीडिया की एक छोटी राशि जोड़ें, 200 μl के बारे में यह नम रखने के लिए ग्रंथि की सतह के लिए. 1mm टुकड़ों में एक ताजा धार के साथ ग्रंथि क़ीमा. कीमा बनाया हुआ ग्रंथि को चार भागों में फूट डालो और संदंश के साथ मीडिया फ्रीज के चार cryovials बीच वितरित. एक Nalgene "श्री ठंढा सेल फ्रीजर जो बाहरी डिब्बे में isopropyl शराब के 250ml है में cryovials रखो -70 ° सी फ्रीजर में 24 घंटे के लिए Nalgene फ्रीजर रखो. स्तन टुकड़े के तरल नाइट्रोजन में जमे हुए शीशियों स्टोर जब तक के लिए आवश्यक प्रत्यारोपण प्रत्येक cryovial पर्याप्त स्तन ग्रंथि के टुकड़े को रोकने के लिए 4 से 8 मेजबान चूहों की मंजूरी दे दी वसा पैड में प्रत्यारोपण.
2. प्रत्यारोपण कक्ष की तैयारी
हमारी प्रयोगशाला अमर स्तन उपकला कोशिका लाइनों, स्तन ट्यूमर सेल लाइनों या एक चूहे में प्राथमिक स्तन कोशिकाओं वसा पैड को मंजूरी दे दी सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं प्रतिरोपित है. प्रत्यारोपण के लिए अल्पविराम - डी कोशिकाओं की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल निम्नानुसार है:
- अल्पविराम - डी कोशिकाओं नियमित एमईसीएल DMEM युक्त मीडिया में सभ्य हैं: F12 2% वयस्क गोजातीय (ABS) सीरम, mEGF, इंसुलिन / एंटीबायोटिक Antimycotic (अटल बिहारी / AM) के साथ पूरक.
- हार्वेस्ट कोशिकाओं अल्पविराम डी जब कोशिकाओं को 85% -90% मिला हुआ हैं.
- 1200rpm पर गोली कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. ताजा एमईसीएल मीडिया में कोशिकाओं Resuspend और 5 मिलीलीटर 6 x 10 / सेल एकाग्रता समायोजित.
प्राथमिक स्तन कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए, प्राथमिक स्तन उपकला कोशिकाओं माउस 5 वीं के स्तन ग्रंथियों से यांत्रिक और enzymatic पृथक्करण के माध्यम से अलग कर रहे हैं. कक्ष DMEM में resuspended F12 मीडिया और इच्छित एकाग्रता के लिए समायोजित, आमतौर पर 5 x 10 6 मिलीग्राम /.
3. माउस स्तन वसा पैड समाशोधन के लिए मानक प्रक्रिया
- तीन सप्ताह पुरानी मेजबान माउस anesthetize. चूहों कि <12 छ करने के लिए सुनिश्चित करें कि स्तन वाहिनीपरक विकास शुरू नहीं किया गया है का चयन करें. हम 2,2,2 - tribromoethanol के शरीर के वजन के 200mg/kg का उपयोग करें.
- बाद माउस anesthetized है, दृढ़ता से माउस को नियंत्रित, उदर की ओर फैलाया अंगों के साथ, एक शल्य चिकित्सा मंच पर इतना है कि पेट ताना है. सर्जरी से पहले, दर्दनाशक दवाओं प्रशासन, या तो (<1mg/kg) bupivacaine या buprenorphine (0.05mg/kg) subcutaneously,.
- कुछ मिलीमीटर की श्रोणि ऊपर संदंश के साथ त्वचा की समझ और यह पेट से ऊपर उठा . जापानी कैंची से त्वचा और शरीर pubis से उरोस्थि के लिए विस्तार की दीवार के माध्यम से एक मध्य बाण के समान कटौती कर. पियर्स वेंट्रल शरीर गुहा के तरल झिल्ली मत करो. अपने प्रारंभिक चीरा भी मूत्रमार्ग के लिए बंद इतना है कि घाव क्लिप माउस को पेशाब करने की क्षमता के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा मत करो.
- प्रारंभिक चीरा से, त्वचा के माध्यम से प्रत्येक हिंद पैर की ओर श्रोणि भर में मध्य लाइन से परोक्ष कटौती कर.
- धीरे तरल झिल्ली को समझ घुमावदार घुमावदार संदंश के क्षेत्र का प्रयोग करें. ऊतक संदंश का प्रयोग त्वचा की कटौती मार्जिन समझ और शरीर दीवार तरल झिल्ली से दूर खींचने के लिए और 5 वीं वंक्षण स्तन ग्रंथि शरीर दीवार के नीचे पर प्रावरणी पर स्थित बेनकाब .
- निपल नोड, और दो नोड (चित्रा 2) के प्रमुख धमनियों दाग़ना
- चौथे और पांचवें ग्रंथियों अलग. 6 वें ग्रंथि से कुदी तसवीर की छाप को रोकने के पांचवें ग्रंथि के मार्जिन दाग़ना.
- बस नोड का उदर (निपल की ओर पक्ष) कैंची के साथ वसा पैड भर काटने से चौथे स्तन ग्रंथि की वसा पैड फूट डालो. घुमावदार संदंश का प्रयोग करने के लिए दृढ़ता से वसा पैड के उदर भाग को समझ और एक टुकड़ा शरीर में दीवार से दूर खींच. दो स्लाइड्स के बीच वसा पैड के उदर भाग प्रेस और एक गिलास ऊतक विज्ञान धुंधला Carnoy लगानेवाला युक्त डिश में डाल दिया. इस ऊतक और तय हो जाएगा कामैन फिटकिरी समाधान के साथ बाद में दाग को मंजूरी दे दी मार्जिन (चित्रा 3) के लिए जाँच करने के लिए. वसा पैड के घुमावदार संदंश के साथ स्तन ग्रंथि के सभी निशान को दूर हटा भाग के क्षेत्र के आसपास प्रावरणी साफ़.
4. वैकल्पिक "फैट पैड समाशोधन के लिए बख्शते प्रक्रिया
के बाद एक माउस स्तन वसा पैड समाशोधन के लिए मानक प्रक्रिया के साथ सक्षम बन गया है, वे कम आक्रामक बख्शते ब्रिल एट अल (2008) 2 द्वारा विकसित की प्रक्रिया का प्रयास पसंद कर सकते हैं.
- माउस के रूप में मानक प्रक्रिया के लिए तैयार.
- चौथे वंक्षण स्तन ग्रंथि के निपल समझ और कैंची की नोक के साथ निप्पल के आसपास एक 3-5 मिमी परिधि सर्कल में कटौती.
- निपल शरीर से दूर खींचो करने के लिए त्वचा की कटौती भाग को अलग और चौथे वंक्षण स्तन ग्रंथि छेद के माध्यम से बाहर निकालना.
- नोड को पहचानें. दाग़ना का प्रयोग करें और छेद के माध्यम से 6 वें स्तन ग्रंथि नोड दाग़ना.
- कट और नोड से पहले सिर्फ 5 वीं स्तन ग्रंथि के सबसे सतही हिस्से को अलग . निपल, त्वचा और स्तन वसा पैड युक्त उपकला के हिस्से के परिपत्र क्षेत्र एक टुकड़ा में हटा रहे हैं.
5. ऊतक / सेल प्रत्यारोपण
- रोपाई उपकला टुकड़े के लिए, defrost उपकला के एक cryovial और ताजा मीडिया युक्त DMSO के बाहर पतला एक पेट्री डिश उपकला टुकड़े हस्तांतरण. एक छोटे से नए उपकला के लिए कैंची टिप के साथ मंजूरी दे दी वसा पैड में छेद या जेब. सुई संदंश के साथ जेब में दाता उपकला के एक 1mm टुकड़ा रखो. जेब ऊतक संदंश के साथ बंद के रूप में आप सुई संदंश वापस ले तो ऊतक जगह में रहता है पकड़ो.
- रोपाई कोशिकाओं के लिए, मीडिया के 10 μl में प्रत्येक वसा एक 22s गेज सुई के साथ एक 50μl हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर पैड में 50,000 कोशिकाओं इंजेक्षन.
6. समापन / माउस के रिवाइवल
- त्वचा को बंद करने के लिए व्यवस्थित. त्वचा के हाशिये विरोध समझ, उन्हें पकड़ एक साथ संदंश के साथ, उन्हें उदर शरीर गुहा के तरल झिल्ली से दूर लिफ्ट और घाव क्लिप के साथ बंद. आमतौर पर, यह दो क्लिप का उपयोग करने के लिए मध्य बाण के समान चीरा और मानक प्रक्रिया के लिए प्रत्येक परोक्ष चीरा लिए एक क्लिप को बंद करने के लिए आवश्यक है. मूत्रमार्ग में बाधा डालने से बचें. यह करने के लिए त्वचा में सीवन के साथ मध्य - बाण के समान और परोक्ष चीरों के चौराहे पर अंतराल बंद आवश्यक हो सकता है. बख्शते प्रक्रिया केवल प्रत्येक पक्ष के लिए एक घाव क्लिप की आवश्यकता होगी.
- . उसे पिंजरे में माउस प्लेस और एक हीटिंग दीपक के तहत पिंजरे रखने के लिए जब तक माउस पुनर्जीवित किया गया है.
- घाव क्लिप 2 हफ्तों के बाद हटा दिया जाना चाहिए.
चित्रा 1 चीरा पैटर्न के प्रदर्शन.
चित्रा 2 लिम्फ नोड, रक्त वाहिकाओं, निप्पल और अंतर्जात उपकला स्थान. स्थानों पर संकेत दाग़ना.
चित्रा 3 साबुत माउंट दर्शाता है कि अंतर्जात उपकला सर्कल के भीतर इस क्षेत्र के लिए प्रतिबंधित है और इसलिए हाशिये 'स्पष्ट हैं.
7. प्रतिनिधि परिणाम
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चित्रा 4 3 सप्ताह पुरानी दिखा माउस को मंजूरी दे दी हाशिये से हटा वसा पैड के पूरे माउंट.
5 चित्रा एक 10 सप्ताह पुरानी वसा अंतर्जात स्तन उपकला की मंजूरी दे दी पैड दिखा माउस से पूरे माउंट.
चित्रा 6 Hematoxylin और eosin मंजूरी दे दी एक 10 सप्ताह पुरानी माउस से वसा पैड के दाग अनुभाग.
7 चित्रा एक 10 सप्ताह पुरानी सामान्य स्तन वाहिनीपरक प्रतिरोपित उपकला से विकसित पेड़ दिखा माउस से पूरे माउंट.
8 चित्रा Hematoxylin और eosin स्तन प्रतिरोपित उपकला से विकसित नलिकाओं का दाग अनुभाग.
चित्रा 9. Hematoxylin और eosin एक स्तन प्रतिरोपित उपकला से विकसित ट्यूमर का दाग अनुभाग.
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Discussion
इस रिपोर्ट में, हम वर्तमान स्तन उपकला प्रत्यारोपण के लिए तैयारी में माउस स्तन वसा पैड समाशोधन के लिए दो वैकल्पिक तरीकों. मानक प्रक्रिया DeOme एट अल द्वारा 1959 में विकास के बाद से उपयोग में किया गया है 1. अधिक आक्रामक जबकि मानक विधि नौसिखिया प्रशिक्षण के लिए पसंदीदा तरीका है क्योंकि संरचना और स्तन ग्रंथि के अभिविन्यास आसानी से देखा जाता है. हालांकि, बख्शते प्रक्रिया कई दो फायदे की वजह से अधिक अनुभवी सर्जन द्वारा पसंद किया जा सकता है . सबसे महत्वपूर्ण बात, बख्शते कम इनवेसिव प्रक्रिया है, कम समय की आवश्यकता है और साँस लेना संज्ञाहरण के एक संक्षिप्त अवधि के प्रदर्शन का उपयोग किया जा सकता है है. यह माउस के लिए वसूली की अवधि कम कर देता है. बख्शते प्रक्रिया भी छोटे (<21 दिनों) चूहों उपकला के सफल निकासी सुनिश्चित करने पर किया जा सकता है है. इसके अलावा, वहाँ सर्जरी जो लाभप्रद हो सकता है अगर प्रयोगों को दोहराने सर्जरी की आवश्यकता प्राथमिक ट्यूमर निकालने के लिए, अभी तक मेटास्टेसिस के लिए माउस के जारी लंबी अवधि के अवलोकन के लिए अनुमति देते हैं हो सकता है के बाद ऊतक आसंजन की कमी है.
प्रक्रिया के प्रत्यारोपण भाग तथ्य यह है कि स्तन ग्रंथि का पूर्ण विकास यौवन के बाद जब तक नहीं होती है का लाभ लेता है है. वसा पैड युक्त अंतर्जात उपकला के छोटे से हिस्से के पहले हटाने युवा माउस के शेष वसा पैड "साफ करता है" और उपकला वाहिनीपरक पेड़ों के विकास के लिए क्षमता समाप्त. प्रायोगिक उपकला मेजबान माउस और जिसके परिणामस्वरूप outgrowths का आकलन की मंजूरी दे दी वसा पैड में प्रत्यारोपित किया जा सकता है अंतर्जात मेजबान उपकला के confounding प्रभाव के बिना किया जा सकता है. इसलिए, इस प्रक्रिया स्तन उपकला कोशिकाओं की क्षमता का आकलन करने के लिए vivo में विकसित करने के लिए उपयोगी है.
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References
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
- Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).
- Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).
- Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
- Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439, 993-997 (2006).
- Medina, D. Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer. Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).
- Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal. Development. 129, 1377-1386 (2002).
- Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice. Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).
