Procedura di trapianto epiteliali mammarie

Summary

Questo articolo illustra la procedura sviluppata da DeOme KB

Abstract

Questo articolo descrive e mette a confronto il grasso procedura di liquidazione pad sviluppato da DeOme KB et al. ¹ e della procedura di risparmio sviluppato da Brill B et al. ^2, seguita dalla procedura di trapianto epiteliali mammarie. La procedura di trapianto mammaria è ampiamente utilizzato dai biologi mammaria perché sfrutta il fatto che lo sviluppo significativo dell'epitelio mammario non avviene solo dopo la pubertà. A 3 settimane di età, la crescita della pianta epiteliali mammarie è limitata alla vicinanza con il capezzolo e il cuscinetto adiposo è in gran parte privo di epitelio mammario, ma da 7 settimane di età dell'albero epiteliale duttale si estende in tutto il cuscinetto di grasso intero. Pertanto, se questa piccola porzione del cuscinetto adiposo contenente epitelio, la regione tra il capezzolo e il linfonodo, viene rimosso a 3 settimane di età, l'epitelio endogeno non sarà mai popolare il pad mammaria grasso e il cuscinetto adiposo è descritto come "cancellato ". In questo momento, epitelio mammario da un'altra fonte possono essere trapiantate nel cuscinetto di grasso eliminato dove si ha la possibilità di estendere mammario duttale alberi attraverso il cuscinetto adiposo. Questa procedura è stata utilizzata in molti modelli sperimentali tra cui l'esame del fenotipo tumorale in transgenico tessuti epiteliali mammarie senza gli effetti confondenti del genotipo sull'animale intero ^3, per l'identificazione delle cellule staminali mammarie trapiantando cellule in diluizione limitato ^4,5, determinando se noduli iperplastici procedere alla tumori mammari ^6, e di valutare l'effetto della esposizione ormonale prima sul comportamento dell'epitelio mammario ^7,8.

Tre topi ospitare settimana di vita sono anestetizzati, puliti e trattenuto in una fase chirurgica. Un sagittale incisione è fatta attraverso la pelle, ma non il peritoneo, che si estende dal pube allo sterno. Tagli obliqui sono realizzate attraverso la pelle a partire dalla metà sagittale incisione in tutto il bacino verso ogni gamba. La pelle è allontanata dal peritoneo per esporre il 4 ghiandola mammaria inguinale. Il cuscinetto adiposo viene cancellata, eliminando il grasso anteriore tessuto pad per il linfonodo. Frammenti di epitelio o cellule epiteliali vengono trapiantate nel restante pad eliminato il grasso e il mouse è chiuso.

Protocol

1. Preparazione del trapianto di epitelio

Tessuto del donatore freschi o surgelati epiteliali possono essere trapiantate nel cuscinetto di grasso eliminato, ma la preparazione prima di epitelio donatore congelato è più conveniente con una diminuzione minima in termini di efficienza trapianto (efficienza> 85%). Il protocollo per la preparazione di epitelio donatore congelato è la seguente:

Prima di preparare trapianto di epitelio donatore, preparare i supporti per congelare epitelio e aliquote di 1 ml in cryovials. Questo può essere conservato a 4 ° C fino a 6 mesi fino al momento dell'uso. Congelare supporto contiene DMEM/F12 supporti tamponata con HEPES e NaHCO _3, 10% di siero fetale bovino (FBS) e il 10% dimetilsolfossido (DMSO).

Harvest epitelio mammario da un mouse di recente eutanasia femminile.

1. Lavare il mouse con il 70% EtOH.
2. Fai una sagittale tagliare la parete del corpo che si estende dal pube allo sterno senza perforare la membrana sierosa della cavità del corpo ventrale. Fare un taglio obliquo dall'incisione iniziale al pube verso ogni zampa posteriore (Figura 1).
3. Sbucciare la parete del corpo lontano dalle membrane sierose per esporre il 5 ^° ghiandola mammaria inguinale attaccato alla fascia sulla parte inferiore della parete del corpo. Il modo migliore per raggiungere questo obiettivo è afferrando le membrane sierose attentamente con la parte ricurva di un paio di pinze curve, facendo attenzione a non forare la cavità del corpo ventrale. Contemporaneamente, afferrare il bordo tagliato del tegumento con diritto pinze dentellate e tirare la parete del corpo lontano dalle membrane sierose.
4. Identificare il linfonodo all'interno della ghiandola mammaria. Il linfonodo si trova all'intersezione di tre vasi sanguigni importanti nella ghiandola mammaria e può essere sentito come un nodulo denso all'interno del cuscinetto adiposo (Figura 2). Con la punta di un paio di forbici occhio, stroncare il tessuto adiposo che circonda il nodo. Con un dito ribalta sul lato epidermico della pelle, applicare una pressione per aumentare il nodo fuori del cuscinetto adiposo e un pizzico fuori con un paio di pinze curve. Eliminare il linfonodo.
5. Mentre si tiene ai margini della pelle, afferrare il cuscinetto di grasso mammaria con il bordo curvo di una coppia di pinze curve e gradualmente il cuscinetto adiposo buccia di distanza dalla parete del corpo. Seguire la direzione del cuscinetto adiposo verso la superficie dorsale del mouse come si rimuove l'intera ghiandola mammaria in un unico pezzo.
6. Mettere la ghiandola mammaria in un blocco sterile taglio di plastica. Aggiungere una piccola quantità di media, circa 200 ul, alla superficie della ghiandola per mantenerlo umido. Tritare la ghiandola in pezzi 1mm con una lama di rasoio fresca. Dividere la ghiandola tritata in quattro porzioni e distribuire tra quattro cryovials dei media congelare con una pinza. Mettere il cryovials in una "cellula congelatore Nalgene Mr. Frosty che ha 250 ml di alcool isopropilico nel compartimento esterno. Mettete il freezer Nalgene in un congelatore ° -70 C per 24 ore. Conservare le fiale congelate di frammenti mammaria in azoto liquido fino al momento di trapianto. Ogni provetta Microbank ™ conterrà frammenti abbastanza ghiandola mammaria di trapiantare nel cuscinetti di grasso eliminato da 4 a 8 topi host.

2. Preparazione del trapianto di cellule

Il nostro laboratorio ha trapiantato diversi tipi di cellule, tra cui immortalato le linee di cellule epiteliali mammarie, mammarie linee di cellule tumorali o cellule primarie mammaria in un topo cancellato cuscinetto adiposo. Il protocollo per la preparazione di Comma-D cellule per il trapianto è la seguente:

1. Comma-D le cellule sono coltivate in normali mezzi di comunicazione MECL contenente DMEM: F12 integrato con 2% siero di bovino adulto (ABS), mEGF, insulina, antibiotica / antimicotica (AB / AM).
2. Harvest Comma-D cellule quando le cellule sono confluenti 85% -90%.
3. Centrifugare la sospensione cellulare a 1200rpm per 5 minuti per far sedimentare le cellule. Risospendere le cellule in fresco mezzi MECL e regolare la concentrazione cellulare di 5 x 10 ⁶ / ml.

Per il trapianto di cellule mammarie primarie, il primario cellule epiteliali mammarie sono isolati dal 5 ^° del mouse ghiandole mammarie attraverso la dissociazione meccanica ed enzimatica. Le cellule sono risospese in DMEM: media F12 e adattata alla concentrazione desiderata, di solito 5 x 10 ⁶ / ml.

3. Procedura standard per la Cancellazione del cuscinetto adiposo mammario mouse

1. Anestetizzare le tre del mouse vecchio host settimana. Selezionare i topi che sono <12 g per garantire che la crescita duttale mammario non è stata avviata. Noi usiamo 200mg/kg di peso corporeo di 2,2,2-tribromoethanol.
2. Dopo che il mouse è anestetizzato, trattenere saldamente il mouse, lato ventrale con le membra distese, su un palco chirurgico in modo che l'addome è provocazione. Prima dell'intervento, amministrare analgesici: o bupivacaina (1mg/kg <) o buprenorfina (0.05mg/kg), per via sottocutanea.
3. Afferrare la pelle con una pinza di pochi millimetri al di sopra del bacino e sollevarlo con l'addome . Nip la pelle con le forbici e per fare un sagittale tagliare la parete del corpo che si estende dal pube allo sterno. Non perforare le membrane sierose del corpo cavità ventrale. Non fate la vostra incisione iniziale troppo vicino l'uretra in modo che le clip ferita non interferisce con la capacità del topo di urinare.
4. Dalla incisione iniziale, fare dei tagli obliqui attraverso la pelle dalla linea mediana in tutto il bacino verso entrambe le zampe posteriori.
5. Utilizzare l'area curva della pinza curva per afferrare delicatamente le membrane sierose. Utilizzare pinze tessuto di cogliere il margine di taglio della pelle e tirare la parete del corpo lontano dalle membrane sierose ed esporre il 5 ^° ghiandola mammaria inguinale trova sulla fascia sulla parte inferiore della parete del corpo.
6. Cauterizzare l', nodo capezzolo e due arterie che conducono al nodo (Figura 2)
7. Separare le ghiandole quarto e quinto. Cauterizzare il margine della ghiandola quinte per evitare che ricrescita dalla ghiandola 6 ^°.
8. Dividere il cuscinetto adiposo della ghiandola mammaria quarto tagliando attraverso il cuscinetto adiposo con le forbici solo ventrale (lato verso il capezzolo) del nodo. Utilizzare pinze curve di afferrare saldamente la parte ventrale del cuscinetto adiposo e tirarlo fuori dalla parete del corpo in un unico pezzo. Premere la parte ventrale del cuscinetto adiposo tra due vetrini e mettere in un piatto di vetro colorazione istologia contenente fissativo Carnoy. Questo tessuto verranno fissate e colorate successivamente con una soluzione di allume carminio per verificare i margini cancellata (Figura 3). Pulire la fascia intorno alla regione della parte rimossa del cuscinetto adiposo per rimuovere tutte le tracce della ghiandola mammaria con le pinzette ricurve.

4. Alternative "Procedura per Sparing Cancellazione del cuscinetto adiposo

Dopo che si è diventati competenti con la procedura standard per la cancellazione del cuscinetto adiposo mammario del mouse, si può preferire di tentare la procedura di risparmiare meno invasiva sviluppata da Brill et al. (2008) ^2.

1. Preparare il mouse come per la procedura standard.
2. Afferrare il capezzolo del quarto ghiandola mammaria inguinale e tagliare un cerchio di 3-5 mm di circonferenza intorno al capezzolo con la punta di forbici.
3. Tirare il capezzolo lontano dal corpo per staccare la parte di taglio della pelle e tracciare il quarto ghiandola mammaria inguinale attraverso il foro.
4. Identificare il nodo. Utilizzare il cauterio per cauterizzare il nodo e il 6 ^° ghiandola mammaria attraverso il foro.
5. Tagliare e staccare la parte più superficiale della ghiandola mammaria 5 ^° appena prima del nodo. L', zona del capezzolo circolare di pelle e porzione di epitelio mammario cuscinetto adiposo contenente vengono rimossi in un unico pezzo.

5. Tessuto / trapianto di cellule

1. Per i frammenti di epitelio trapianto, sbrinamento uno provetta Microbank ™ di epitelio e trasferire i frammenti epiteliali di una piastra di Petri contenente mezzi freschi per diluire il DMSO. Fai un piccolo foro o in tasca il cuscinetto di grasso eliminato con punta a forbice per il nuovo epitelio. Mettete un pezzo di epitelio 1 millimetro donatore nella tasca con una pinza ago. Tenere la tasca chiusa con una pinza il tessuto quando si estrae il forcipe ago in modo che il tessuto rimane in vigore.
2. Per il trapianto di cellule, iniettare 50.000 cellule in 10 l di media in ogni pad grasso usando una siringa 50μl Hamilton con un ago calibro 22s.

6. Chiusura / Revival di mouse

1. Disporre la pelle per la chiusura. Afferrare opposti margini di pelle, li tengono insieme con le pinze, ascensore via dalle membrane sierose del corpo cavità ventrale e chiudere con clip ferita. In genere, è necessario utilizzare due clip per chiudere la sagittale incisione e una clip per ogni incisione obliqua per la procedura standard. Evitare di ostruire l'uretra. Può essere necessario per colmare le lacune nella pelle nel punto di intersezione delle incisioni sagittale e obliquo con una sutura. La procedura risparmiando richiede solo una clip ferita per ogni lato.
2. . Posizionare il mouse nella sua gabbia e tenere la gabbia sotto una lampada di riscaldamento fino a quando il mouse ha fatto rivivere.
3. Le clip ferita deve essere rimosso dopo 2 settimane.

Figura 1. Dimostrazione di disegno incisione.

Figura 2. Luogo di linfonodi, vasi sanguigni, capezzolo e l'epitelio endogena. Cauterizzare in luoghi indicati.

Montare Figura 3. Whole dimostra che l'epitelio endogena è limitata alla zona all'interno del cerchio, e quindi i margini sono "chiari '.

7. Rappresentante Risultati

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Figura 4. Montare intere di cuscinetto adiposo rimosso da 3 topo settimana di vita mostrando margini cancellata.

Figura 5. Montare intero da un mouse 10 settimane vecchio mostrando rimozione del cuscinetto adiposo endogene dell'epitelio mammario.

Figura 6. Ematossilina e eosina sezione macchiato di un cuscinetto di grasso eliminato da un mouse 10 settimane di età.

Figura 7. Montare intero da un mouse 10 settimane vecchio che mostra normale albero mammario duttale sviluppato da epitelio trapiantato.

Figura 8. Ematossilina e eosina sezione macchiato di dotti mammari sviluppate da epitelio trapiantato.

Figura 9. Ematossilina e eosina sezione macchiato di un tumore mammario sviluppato da epitelio trapiantato.

Discussion

In questo rapporto, presentiamo due metodi alternativi per la pulizia del cuscinetto adiposo mammario del mouse in preparazione per i trapianti epiteliali mammarie. La procedura standard è stato in uso dal suo sviluppo nel 1959 da DeOme et al. ¹ Mentre più invasivo, il metodo standard è il metodo preferito per la formazione del novizio perché la struttura e l'orientamento della ghiandola mammaria sono facilmente visualizzati. Tuttavia, la procedura risparmiando può essere preferito dal chirurgo più esperto a causa di numerosi vantaggi ^2. Ancora più importante, la procedura risparmiando è meno invasiva, richiede meno tempo e può essere eseguita utilizzando un breve periodo di anestesia per inalazione. Questo riduce il periodo di recupero per il mouse. La procedura di risparmio può essere eseguita anche in topi giovani (<21 giorni) per un franco successo di epitelio. Inoltre, vi è una riduzione di adesione tissutale dopo l'intervento chirurgico che può essere vantaggioso se gli esperimenti richiedono un intervento chirurgico per rimuovere ripetere tumori primari, ma favorire il mantenimento di osservazione a lungo termine del mouse per metastasi.

La porzione di trapianto della procedura sfrutta il fatto che lo sviluppo pieno della ghiandola mammaria non si verifica se non dopo la pubertà. Previa rimozione della piccola porzione del cuscinetto adiposo contenente l'epitelio endogeno "cancella" il cuscinetto di grasso residuo del mouse giovani ed elimina il potenziale per lo sviluppo di alberi epiteliale duttale. Epitelio sperimentali possono essere trapiantate nel cuscinetto di grasso eliminato del mouse di accoglienza e valutazione delle escrescenze risultante può essere fatta senza gli effetti confondenti dell'epitelio ospite endogena. Pertanto, questa procedura è utile per valutare la capacità delle cellule epiteliali mammarie di sviluppare in vivo.