乳腺上皮移植の手順

Summary

この記事ではDeOme KBで開発した手順を示しています

Abstract

この記事ではDeOmeキロバイトら ¹ブリルB らが開発温存手順によって開発された脂肪パッドのクリアランスの手順を説明し、比較する^2、乳腺上皮移植の手続きが続く。それは乳腺上皮の著しい発展は、思春期後まで発生しないという事実が利用されるため乳腺移植の手順は、広く乳腺生物学者によって使用されます。生後3週で、乳腺上皮木の成長は、乳首の近傍に限定されていると脂肪パッドは、乳腺上皮の大部分を欠いているが、7週齢で上皮管ツリー全体脂肪体全体に拡張。したがって、上皮を含む脂肪パッドのこの小さな部分は、乳首やリンパ節の間の領域は、生後3週間で削除された場合、内因性上皮は乳腺脂肪体に移入することはありませんし、脂肪パッドは、"クリアとして記述されています"。この時点で、別のソースからの乳腺上皮は、それは脂肪体全体を通して乳管の木を拡張する可能性を秘めているクリア脂肪体に移植することができる。この手順は、決定^、4,5限られた希釈で細胞を移植することにより、乳腺幹細胞の同定には、全体の動物の³遺伝子型の交絡影響することなくトランスジェニック乳腺上皮組織における腫瘍表現型の検査を含む多くの実験モデルで利用されている過形成結節は、乳腺腫瘍⁶に進みますし、乳腺上皮^7,8の挙動に関する事前のホルモン暴露の影響を評価する場合。

三週齢の宿主マウスは、麻酔きれいにして外科的ステージに抑制。半ば矢状切開は恥骨から胸骨まで延びる、皮膚ではなく、腹膜を介して行われます。斜めカットは、それぞれの脚に向かって骨盤全体の半ばに矢状切開から皮膚を介して行われます。皮膚は4鼠径乳腺を公開するために離れて腹膜からプルされます。脂肪パッドは、リンパ節への脂肪パッドの組織の前方を削除することによってクリアされます。上皮のフラグメントまたは上皮細胞は、残りのクリア脂肪体に移植され、マウスが閉じられます。

Protocol

1。移植上皮の準備

新鮮または凍結ドナー上皮組織はクリア脂肪パッドに移植したが、凍結ドナー上皮の事前準備は、移植効率の最小限の低下（> 85％の効率）とより便利ですできます。次のように凍結ドナー上皮の準備のためのプロトコルは、次のとおりです。

ドナーの移植の上皮を準備する前に、cryovialsに1ミリリットル約上皮、アリコートのために凍結するメディアを準備する。必要になるまでこれは、6ヶ月までは4℃で保存することができます。凍結メディアはDMEM/F12 HEPESおよびNaHCO ₃で緩衝培地、10％ウシ胎児血清（FBS）および10％ジメチルスルホキシド（DMSO）が含まれています。

最近安楽死させた雌マウスから乳腺上皮を採取。

1. 70％EtOHでマウスを洗ってください。
2. 腹側体腔の漿液膜を貫通することなく、恥骨から胸骨に至る体壁を通して半ば矢状切断してください。各後肢（図1）に向かって恥骨で最初の切開から斜めのカットを行います。
3. 体壁の裏側に筋膜に接続された^第 5 ^回鼠径部乳腺を公開するために離れて漿液膜から体壁ピール。これを達成する最良の方法はないピアス腹側の体腔に注意して、曲がったピンセットの湾曲部を慎重に漿液膜を把握することです。同時に、直線鋸歯状の鉗子と外皮のカットエッジをつかみ、漿液膜から体壁を引き出します。
4. 乳腺内のリンパ節を特定する。リンパ節は、乳腺の3つの主要な血管の交差点に位置し、脂肪パッド（図2）内に密度の高い小結節として感じることができる。目のはさみの先端で、ニップノードを取り巻く脂肪組織。皮膚の表皮側の人差し指で、脂肪パッドのノードの出力を高め、湾曲したピンセットでそれを挟まないように圧力を適用する。リンパ節を捨てる。
5. 皮膚のマージンを押しながら、曲がったピンセットの湾曲した縁で、徐々に体壁から脂肪パッドピール乳腺脂肪体を把握する。あなたが一体で全体乳腺を除去するように、マウスの背側表面に向かって脂肪パッドの方向に従ってください。
6. 滅菌プラスチックの切削ブロックで乳腺を置く。それは湿った保つために腺の表面に、200μlの程度、小容量のリムーバブルメディアを追加。新鮮なカミソリの刃で1mmの部分に腺を飾らない。 4つの部分にみじん切りの腺を分割し、鉗子で凍結メディアの4つのcryovials間で配布する。外側のコンパートメントにイソプロピルアルコールの250ミリリットルいるNalgene"ミスターフロスティ細胞の冷凍庫にcryovialsを置く。24時間70℃以下の冷凍庫でNalgeneの冷凍庫に入れて。ために必要になるまで液体窒素中に乳腺の断片の凍結バイアルを保存移植各クライオバイアルは4〜8宿主マウスのクリア脂肪パッドに移植するのに十分な乳腺のフラグメントが含まれます。

2。移植細胞の調製

私たちの研究室では、脂肪パッドをクリアマウスに不死化乳腺上皮細胞株、乳腺腫瘍細胞株またはプライマリ乳腺細胞を含むさまざまな種類の細胞を、移植しています。次のように移植するためのカンマ- D細胞の調製のためのプロトコルは、次のとおりです。

1. コンマ- D細胞は、DMEMを含む正規MECL培地で培養されています：F12、2％アダルト牛血清（ABS）、mEGF、インスリン、抗生物質/抗真菌剤（AB / AM）を補充した。
2. 収穫のカンマ- D細胞が85％-90％コンフルエントの細胞。
3. 細胞をペレットに5分間1200rpmで細胞懸濁液を遠心してください。新鮮なMECLメディアで細胞を再懸濁し、5 × 10 ^6個 / mlに細胞濃度を調整する。

主な乳腺細胞の移植のために、主要な乳腺上皮細胞はマウス5 ^番目の乳腺からの機械的および酵素的解離によって分離されています。 F12のメディアをして所望の濃度に調整し、通常5 × 10 ^6個 / ml：細胞は、DMEMに再懸濁する。

3。マウス乳腺脂肪体をクリアするための標準手順

1. 三週間、古いホストのマウスを麻酔。 <12 gが乳管の成長が開始されていないことを保証するためであるマウスを選択します。我々は、2,2,2 - トリブロムエタノールの体重から200mg/kg使用。
2. マウスに麻酔をした後に腹部が愚弄になるように、しっかりと手術のステージで、広げた手足と、腹側にマウスを抑制する。手術前に、鎮痛薬を管理し、ブピバカイン（<1mg/kg）またはブプレノルフィン（0.05mg/kg）のどちらか、皮下。
3. 数ミリの骨盤上記鉗子で皮膚をつかみ、腹部からそれを持ち上げる 。ニップは、はさみで皮膚と恥骨から胸骨に至る体壁を通して半ば矢状カットを作るために。腹側体腔のピアス漿液膜はしないでください。創傷クリップが排尿するためにマウスの能​​力と干渉しないように、あまりにも尿道の近くに最初の切開を行わないでください。
4. 最初の切開から、各後肢に向かって骨盤全体の半ばラインから皮膚を通して斜めのカットを行います。
5. 優しく漿液膜を把握するために湾曲鉗子の湾曲した領域を使用します。皮膚のカットマージンをつかみ、漿液膜から体壁を引くと体壁の下側の筋膜上にある5 ^番目の鼠径部乳腺を公開する組織鉗子を使用してください。
6. ニップル、ノードとノード（図2）に先頭に2つの動脈を焼灼する
7. 第四および第五腺を区切ります。 6 ^番目の腺から内部成長を防ぐために、第五腺のマージンを焼灼する。
8. ノードの（ニップルに向かって側）だけで腹をはさみで脂肪パッドを横断する4つ目の乳腺の脂肪パッドを割ります。しっかりと脂肪体の腹側部分を把握し、一枚で体壁からそれを引き離しに曲がったピンセットを使用してください。つのスライド間で脂肪体の腹側部分を押すと、カルノア固定液を含むガラスの組織学的染色皿に入れ。この組織は、クリアマージン（図3）を確認するために固定されており、カルミンのミョウバン液で後染色されます。湾曲鉗子で乳腺のすべての痕跡を除去する脂肪パッドの除去部分の領域の周囲の筋膜を清掃してください。

4。脂肪パッドをクリアするための代替"スペアリングの手順

いずれかのマウス乳腺脂肪パッドをクリアするための標準手順で有能になった後、彼らはブリルら ^（2008）2によって開発された低侵襲温存の手順を試みることを好むことがあります。

1. 標準的な手順と同様にマウスを準備します。
2. 第四鼠径乳腺の乳首をつかみ、ハサミの先端で乳首の周りに3〜5ミリメ​​ートルの円周の円をカット。
3. 皮膚のカット部分を切り離し、穴から第四鼠径部乳腺を引き出すために離れて身体から乳首を引っ張る。
4. ノードを識別します。スルーホールノードと6 ^番目の乳腺を焼灼するために焼灼を使用しています。
5. 単にノードの前に^第 5 ^回乳腺の最も表面的な部分をカットして切り離す。ニップル、上皮を含む乳腺脂肪体の皮膚と部分の円形の領域が一体的に削除されます。

5。組織/細胞移植

1. 上皮の破片、霜上皮のクライオバイアルを移植するとDMSOを希釈するために新鮮な培地を含むペトリ皿に上皮フラグメントを転送する。新しい上皮用はさみ先端とクリア脂肪パッドに小さな穴やポケットを作る。針の鉗子とポケットにドナーの上皮の1mmの部分を置く。組織の場所に残っているように、針の鉗子を撤回として組織鉗子で閉じてポケットホールド。
2. 細胞を移植するために、22秒計の針と50μlのハミルトンシリンジを用いて各脂肪パッドへのメディアの10μlに50,000個の細胞を注入する。

6。閉会/マウスのリバイバル

1. 閉会のスキンを手配。皮膚のマージンを反対つかみ、、鉗子でそれらを一緒に押したまま腹体腔の漿液膜から離して持ち上げ、創傷クリップで閉じてください。一般的に、それは半ば矢状切開と標準的な手順については、各斜切開用のクリップを閉じるには、2つのクリップを使用する必要があります。尿道を閉塞することは避けてください。それは、縫合糸の半ばに矢状と斜切開の交差点で皮膚のギャップを埋めるために必要な場合があります。スペア手順は、各サイド用の創傷クリップが必要になります。
2. 。彼女のケージにマウスを置いて、マウスが復活するまで加熱ランプの下にケージを保つ。
3. 創傷クリップは、2週間後に削除する必要があります。

図1。切開パターンのデモンストレーション。

図2リンパ節、血管、乳頭および内因性上皮のロケーション。指定された場所で焼灼する。

図3。ホールマウントは、その内因性上皮が円内の領域に限定し、したがって、マージンは""明確にされている証拠です。

7。代表的な結果

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図4。消去のマージンを示す3週齢のマウスから取り外した脂肪パッドのホールマウント。

図5。内因性の乳腺上皮のクリア脂肪パッドを示す10週齢のマウスからの全マウント。

図6 10週齢のマウスからクリア脂肪パッドのヘマトキシリンおよびエオシン染色切片。

図7。移植上皮から開発された正常な乳管ツリーを示す10週齢のマウスからの全マウント。

図8。移植上皮から開発された乳管のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片。

図9。移植上皮から開発された乳腺腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片。

Discussion

このレポートでは、我々は、乳腺上皮移植の準備のためにマウス乳腺脂肪パッドをクリアするための2つの代替方法を提示する。標準的な手順はDeOme らによる1959年に開発から使用されています^。1は、より侵襲が、乳腺の構造と配向が容易に閲覧されているため、標準的な方法は、初心者を訓練するための好ましい方法です。しかし、温存手続きがあるため、いくつかの利点²のより多くの経験豊富な外科医が好ましいことがある。最も重要なことは、スペアリングの手順は、低侵襲であるより少ない時間を必要とし、吸入麻酔の短い期間を使用して実行することができます。これはマウスのための回復期間が短縮されます。スペアリングの手順は、上皮の正常なクリアランスを確保する若いマウス（<21日間）に行うことができます。さらに、実験では転移のためのマウスの継続的な長期的な観察を可能にするまだ、原発腫瘍を摘出する手術を繰り返す必要がある場合は有利かもしれない手術後の組織の癒着の減少がある。

手続きの移植部分は、乳腺の完全な発展が思春期後まで発生しないという事実を活用しています。内因性上皮を含む脂肪体の小さな部分の除去前には、若いマウスの残りの脂肪パッドを"クリアする"と上皮管樹木の開発の可能性がなくなります。実験的上皮は、内因性の宿主の上皮の交絡影響することなく行うことができますホストのマウスと結果outgrowthsの評価のクリア脂肪パッドに移植することができます。したがって、この手順は、 生体内で開発するために乳腺上皮細胞の能力を評価するのに便利です。