Summary
이 문서 DeOme 킬로바이트 개발한 절차를 보여줍니다
Abstract
이 문서에서는 설명하고 DeOme 킬로바이트 외 개발한 지방 패드 통관 절차를 비교합니다. 1 브릴 B 외 개발한 살려주는 절차를. 2, 내유 상피 이식 절차가옵니다. 그것은 내유 상피의 중요한 개발 사춘기 전까지는 발생하지 않는다는 사실을 활용하기 때문에 내유 이식 절차는 널리 내유 생물학 자에 의해 사용됩니다. 연령 3 주가, 내유 상피 나무의 성장은 유두 부근에 갇혀 있으며, 지방 패드 내유 상피의 대부분 찾아볼 수 있지만, 나이 7주하여 상피 ductal 나무가 전체 지방 패드에 걸쳐 확장됩니다. 따라서 상피를 포함하는 지방 패드의이 작은 부분, 유두 및 림프 노드 사이의 지역은, 시대의 삼주에서 제거하면, 내생 상피는 내유 지방 패드를 삽입하지 않습니다 그리고 지방 패드는 "해제로 설명되어 있습니다 ". 이때, 다른 소스에서 내유 상피는 그것이 지방 패드 밖으로 내유 ductal 나무를 확장할 수있는 가능성이 해제 지방 패드에 이식 수 있습니다. 이 절차는 결정, 4,5 제한 희석에 세포를 이식하여 내유 줄기 세포의 식별에, 전체 동물 3 유전자형의 혼란함을 주죠 효과없이 유전자 변형 내유 상피 조직의 종양 표현형의 심사 등 많은 실험 모델로 이용되어 hyperplastic nodules는 내유 종양 6을 진행하고, 내유 상피 7,8의 행동에 대한 사전 호르몬 노출의 효과를 평가한다면.
3 주 된 호스트 마우스, anesthetized 아르 청소하고 수술 무대에서 구속. 중간 화살 절개는 피부를 통해서도했지만, 치골에서 흉골을 연장하지 복막. 것입니다 경사 인하는 각 다리 방향으로 골반에 걸쳐 중반 화살 절개부터 피부를 통해서 만들어집니다. 피부는 4 사타구니 유선을 폭로하기 위해 멀리 복막에서 가져온 것입니다. 지방 패드가 림프절로 지방 패드 조직 앞쪽에를 제거하여 지워집니다. 상피 조각이나 상피 세포가 남아있는 해제 지방 패드로 이식되고 마우스가 닫힙니다.
Protocol
1. 이식 상피의 준비
신선 또는 냉동 기증자 상피 조직은 해제 지방 패드로 이식하지만, 냉동 기증자 상피의 사전 준비 이식 효율에 최소한의 감소 (> 85 % 효율)가 더 편리합니다 수 있습니다. 다음과 같이 냉동 기증 상피의 준비를 위해 프로토콜은 다음과 같습니다 :
기증자 이식 상피를 준비하기 전에, cryovials에 1ml에 대한 상피와 나누어지는에 대한 동결 미디어를 준비합니다. 필요한 때까지 이것은 최대 6 개월까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 고정 미디어 HEPES 및 NaHCO 3 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 10 %의 디메틸 sulphoxide (DMSO)와 버퍼 DMEM/F12 미디어를 포함하고 있습니다.
최근 euthanized 여성 마우스 내유 상피를 수확.
- 70 % EtOH로 마우스를 씻으십시오.
- 복부 뱃속의 장액의 세포막을 관통하지 않고 치골에서 흉골에 걸쳐 신체의 벽을 통해 중간 화살 절단하십시오. 각 뒷다리 다리 (그림 1) 방향으로 치골의 초기 절개에서 경사 절단하십시오.
- 거리에 시체 벽 아래쪽에있는 근막에 첨부된 5 일 사타구니 유선을 노출하는 장액의 세포막에서 몸을 벽 껍질. 이것을 달성하는 가장 좋은 방법은 아니 피어스 배면의 뱃속에주의하고, 곡선 포셉의 쌍 곡선 부분과 함께주의 깊게 장액의 세포막을 쥐고 것입니다. 동시에, 직선 톱니 모양의 집게와 외피의 절단 가장자리를 파악하고 거리에 장액의 세포막에서 몸을 벽을 가져옵니다.
- 유선 내에 림프 노드를 식별합니다. 림프절은 유선 세 저명한 혈관의 교차로에 위치하고 있으며 지방 패드 (그림 2) 내에서 고밀도 결절로 느낄 수 있습니다. 눈 가위, 노드를 둘러싼 따다 지방 조직의 쌍 끝으로. 피부의 표피쪽에 포어 손가락으로, 지방 패드의 노드 밖 인상과 곡선 포셉 한 쌍의로를 공략 압력을 적용합니다. 림프 노드를 폐기하십시오.
- 피부의 여백을 누른 상태, 곡선 포셉의 쌍 곡선 가장자리와 점점 거리 신체 벽에서 지방 패드 껍질 내유 지방 패드를 파악. 한 조각의 전체 유선을 제거로 마우스 등의 표면을 향해 지방 패드의 방향을 따르십시오.
- 멸균 플라스틱 절단 블록에 유선 놔. 이 촉촉한 유지하는 선 (腺)의 표면에, 200 μl에 대한 미디어의 작은 금액을 추가합니다. 신선한 면도날로 1mm의 조각에 선 (腺)을 말하다. 네 부분으로 다진 선을 나누어 집게로 고정 매체 네 가지 cryovials 사이에 배포할 수 있습니다. 외부 구획에 이소 프로필 알코올의 250ml 가진 Nalgene '미스터 프로 스티 셀 냉동실에 cryovials 넣어. 24 시간 동안 -70 ° C의 냉동고에 Nalgene 냉장고 놔. 필요한 때까지 액체 질소에 내유 조각 냉동 튜브를 저장 이식은. 각 cryovial은 4-8 호스트 마우스의 해제 지방 패드에 이식하기에 충분한 유선 조각이 포함됩니다.
2. 이식 세포의 준비
우리 연구실은 불후의 내유 상피 세포 라인, 내유 종양 세포 라인 또는 마우스에 기본 내유 세포 지방 패드를 해제 포함한 다양한 셀 유형을 이식했다. 다음과 같이 이식을위한 쉼표 - D 세포의 준비를 위해 프로토콜은 다음과 같습니다 :
- 쉼표 - D 세포는 DMEM을 포함하는 일반 MECL 미디어 양식입니다 F12는 2퍼센트 성인 소 혈청 (ABS), mEGF, 인슐린, Antimycotic / 항생제 (AB / AM)과 보완.
- 하베스트 쉼표 - D 세포 세포 85 % -90 %의 합류 때.
- 펠렛 세포 5 분 동안 1200rpm에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 신선한 MECL 미디어 세포를 Resuspend 5 × 10 6 / ML에 세포 농도를 조정합니다.
기본 내유 세포의 이식은 기본 내유 상피 세포는 마우스 5 일 내유 땀샘에서 기계 및 효소 분해를 통해 고립됩니다. F12 미디어를하여 원하는 농도 조정, 보통 5 × 10 6 / ML : 세포 DMEM에 resuspended 있습니다.
3. 마우스 내유 지방 패드를 비우는 방법에 대한 표준 절차
- 삼주 이전 호스트 마우스를 마취. 내유 ductal 성장이 시작되지 않았음을 보장하기 위해 <12g 아르 생쥐를 선택합니다. 우리는 2,2,2 - tribromoethanol의 체중 200mg/kg 사용합니다.
- 마우스 anesthetized 후 복부가 조롱이다 있도록 단단히 수술 무대에 뻗은 팔다리와 복부 쪽 마우스를 구속. 이전 수술로 진통제를 관리, bupivacaine (<1mg/kg) 또는 buprenorphine (0.05mg/kg) 중 하나는 subcutaneously.
- 몇 mm 골반 위 포셉로 피부를 파악하고 복부에서 올려 . 니프는 가위로 피부와 치골에서 흉골에 걸쳐 신체의 벽을 통해 중간 화살 몫을 할 수 있습니다. 복부 뱃속의 피어스 장액의 세포막은하지 마십시오. 상처 클립은 소변을 마우스의 능력에 방해가되지 않도록하여 초기 절개도 요도에 가까이하지 마십시오.
- 초기 절개에서 각 뒷다리 다리를 향해 골반에 걸쳐 중반 선에서 피부를 통해서도 경사 인하합니다.
- 부드럽게 장액의 세포막을 파악하기 위해 곡선 포셉의 곡선 영역을 사용합니다. 피부의 상처 여백을 파악하고 거리에 장액의 세포막에서 몸을 벽을 끌어와 본문 벽 아래쪽에있는 근막에있는 5 일 사타구니 유선을 폭로하기 위해 조직 집게를 사용하십시오.
- 젖꼭지, 노드와 노드 (그림 2)로 이어지는이 동맥을 부식
- 네 번째와 다섯째 분비를 분리합니다. 6 회 선의 안쪽으로의 성장을 방지하기 위해 다섯 번째 선 (腺)의 여백을 부식.
- 노드의 (유두쪽으로 쪽) 그냥 가위로 복부 지방 패드를 통해 절단에 의해 네 번째 유선의 지방 패드를 나누십시오. 단단히 지방 패드의 복부 부분을 파악하고 한 조각의 몸 벽에서 멀리 잡아 곡선 집게를 사용하십시오. 두 슬라이드 사이에 지방 패드의 복부 부분을 누르면 Carnoy의 정착액을 포함하는 유리의 조직학 얼룩 요리에 넣어. 이 조직은 고정 및 해제 마진 (그림 3)를 확인하기 위해 카르민 명반 솔루션 나중에 물들일 것이다. 곡선 포셉과 유선의 모든 흔적을 제거하는 지방 패드의 제거 부분의 지역 주변의 근막를 청소합니다.
4. 지방 패드를 비우는 방법에 대한 대체 "아끼며 사용하는 방법
하나는 마우스 내유 지방 패드를 비우는 방법에 대한 표준 절차와 능력이 될 후에, 그들은 브릴 외. (2008) 2 개발한 적은 침입 살려주는 절차를 시도하는 것이 좋습니다.
- 표준 절차로 마우스를 준비합니다.
- 네번째 사타구니 유선의 젖꼭지를 잡고 가위 끝에있는 유두 주변 3-5mm의 둘레 서클 컷.
- 피부의 상처 부분을 분리하고 구멍을 통해 네 번째 사타구니 유선을 그려 멀리 떨어진 신체의 젖꼭지를 당겨.
- 노드를 식별합니다. 구멍을 통해 노드와 6 일 유선을 부식하는 소작을 사용합니다.
- 그냥 노드 앞에 5 일 유선의 가장 피상적인 부분을 잘라 분리. 피부 및 내유 지방 패드가 포함된 상피 부분의 젖꼭지, 원형 지역은 한 조각으로 제거됩니다.
5. 조직 / 세포 이식
- 이식 상피 조각 들어, 서리를 없애다 상피의 cryovial와 DMSO를 희석하기 위해 새로운 미디어를 포함하는 페트리 접시에 상피 조각을 전송합니다. 새로운 상피에 대한 가위 팁으로 지워 지방 패드의 작은 구멍이나 주머니를 확인하십시오. 바늘 집게와 포켓에 기증 상피의 1mm의 조각을 넣어. 조직이 자리에 남아 있도록 바늘 집게를 철회 등 조직 포셉과 닫힌 주머니를 잡아.
- 이식 세포의 경우, 22s 게이지 바늘로 50μl 해밀턴 주사기를 사용하여 각 지방 패드로 미디어 10 μl의 세포를 주입 50000.
6. 휴관일 / 마우스의 리바이벌
- 폐쇄 피부를 정렬. 피부의 여백을 반대 이해, 포셉 그들을 함께 보유하고있는 복부 뱃속의 장액의 세포막에서 멀리 리프트와 상처에 클립 닫습니다. 일반적으로, 그것은 중간 화살 절개 및 표준 절차에 대한 각각의 경사 절개 하나의 클립을 닫습니다 두 클립을 사용해야합니다. 요도를 방해하지 마십시오. 그것은 치료와 함께 중간 화살과 경사 incisions의 교차로에서 피부에 격차를 가까이 할 수 있습니다. 살려주 절차는 각 측면에 대해 하나 상처 클립이 필요합니다.
- . 그녀의 새장에 마우스를 놓고 마우스가 부활 때까지 가열 램프 아래에있는 새장을 유지.
- 상처 클립 2 주 후에 제거되어야합니다.
그림 1. 절개 패턴의 데모.
그림 2. 림프절, 혈관, 유두 및 내생 상피의 위치. 위치에 표시를 부식.
그림 3. 전체 마운트는 내생 상피는 동그라미 내의 지역 제한 때문에 마진이 ' "분명합니다 보여줍니다.
7. 대표 결과
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그림 4. 지워집 여백을 보여주는 삼주 이전 마우스에서 제거 지방 패드의 전체 탑재합니다.
그림 5. 내생 내유 상피에서 벗어날 지방 패드를 보여주는 10주 된 마우스에서 전체 탑재합니다.
그림 6. Hematoxylin 및 10주 된 마우스에서 지워집 지방 패드의 eosin 스테인드 섹션을 참조하십시오.
그림 7. 이식 상피에서 개발된 일반 내유 ductal 나무를 보여주는 10주 된 마우스에서 전체 탑재합니다.
그림 8. Hematoxylin 및 이식 상피에서 개발 내유 관의 eosin 스테인드 섹션을 참조하십시오.
이식 상피에서 개발한 내유 종양의 그림 9. Hematoxylin 및 eosin 스테인드 섹션을 참조하십시오.
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Discussion
이 보고서에서는, 우리는 내유 상피 이식을위한 준비에서 마우스 내유 지방 패드를 청소 두 가지 다른 방법을 제시한다. 표준 절차는 DeOme 외 의해 1959 년 개발 이후 사용되었습니다. 1보다 침략 동안 유선의 구조와 방향을 쉽게 볼되기 때문에, 표준 방법은 초보자 훈련에 대한 선호하는 방법입니다. 그러나, 살려주는 프로 시저가 있기 때문에 몇 가지 장점 2의 경험 많은 외과 의사에 의해 선호 수 있습니다. 가장 중요한 살려주는 절차가 덜 침략적이며, 적은 시간이 필요하며 흡입 마취의 간단한 기간을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이것은 마우스에 대한 복구 기간을 줄일 수 있습니다. 살려주 절차는 상피의 성공적인 허가를 보장하는 젊은 생쥐 (<21일)에서 수행할 수 있습니다. 또한, 실험 전이에 대한 마우스의 지속적인 장기 관찰을 허용 아직 기본 종양을 제거하는 반복 수술이 필요한 경우 유리한 수 있습니다 수술 후 조직 유착의 감소가 있습니다.
프로 시저의 이식 부분은 유선의 전체 개발 사춘기 전까지는 발생하지 않는다는 사실을 활용합니다. 내생 상피를 포함하는 지방 패드의 작은 부분의 사전 제거 젊은 마우스의 나머지 지방 패드를 "무죄"와 상피 ductal 나무의 개발 가능성을 제거합니다. 실험 상피는 내생 호스트 상피의 혼란함을 주죠 효과없이 만들 수 있습니다 호스트 마우스 및 결과 outgrowths 평가의 해제 지방 패드로 이식 수 있습니다. 따라서이 절차는 생체내에서 개발하는 내유 상피 세포의 능력을 평가하는 데 유용합니다.
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References
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
- Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).
- Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).
- Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
- Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439, 993-997 (2006).
- Medina, D. Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer. Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).
- Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal. Development. 129, 1377-1386 (2002).
- Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice. Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).
