Procedimento de transplante do epitélio mamário

Summary

Este artigo demonstra o procedimento desenvolvido por DeOme KB

Abstract

Este artigo descreve e compara o processo de apuramento de gordura pad desenvolvido pela DeOme KB et al. ¹ e poupando o procedimento desenvolvido por Brill B et al. ^2, seguido pelo procedimento de transplante mamárias epiteliais. O procedimento de transplante de mama é amplamente utilizado por biólogos mamárias porque ele tira vantagem do fato de que um maior desenvolvimento do epitélio mamário não ocorre até depois da puberdade. Menos 3 semanas de idade, o crescimento da árvore mamárias epiteliais se limita à vizinhança do mamilo ea almofada de gordura é em grande parte desprovida de epitélio mamário, mas por sete semanas de idade da árvore do epitélio ductal se estende por todo o bloco inteiro de gordura. Portanto, se esta pequena porção do bloco de gordura contendo epitélio, na região entre o mamilo eo nó de linfa, é removida a 3 semanas de idade, o epitélio endógena nunca vai preencher o pad mamárias gordura ea gordura abdominal é descrita como "apagada ". Neste momento, epitélio mamário de outra fonte pode ser transplantado no bloco limpo de gordura onde ela tem o potencial para estender mamário ductal árvores por todo o bloco de gordura. Este procedimento tem sido utilizado em muitos modelos experimentais, incluindo a análise do fenótipo de tumor no tecido mamário transgênicos epiteliais sem os efeitos de confusão do genótipo sobre todo o animal ^3, na identificação de células-tronco mamário através do transplante de células em diluição limite ^{de 4,5,} determinando se nodules hyperplastic proceder para tumores mamários ^6, e para avaliar o efeito da exposição a hormônios prévio sobre o comportamento do epitélio mamário ^7,8.

Três semanas os ratos são anestesiados anfitrião velho, limpo e contido em um estágio cirúrgico. Uma incisão médio-sagital é feita através da pele, mas não o peritônio, que se estende do púbis ao esterno. Cortes oblíquos são feitas através da pele da incisão médio-sagital do outro lado da pelve para cada perna. A pele é puxada para longe do peritônio para expor a glândula mamária inguinal 4. A gordura abdominal é limpo com a remoção do tecido adiposo anterior pad para o nó de linfa. Fragmentos de epitélio ou células epiteliais são transplantadas para o teclado limpo restantes gordura eo mouse está fechado.

Protocol

1. Preparação do Epitélio Transplant

Tecido do doador frescos ou congelados epitelial pode ser transplantado para a almofada limpa de gordura, mas a preparação prévia do epitélio do doador congelado é mais conveniente, com uma redução mínima na eficiência de transplante (> 85% de eficiência). O protocolo para a preparação do epitélio do doador congelados é a seguinte:

Antes de preparar epitélio transplante de doadores, preparar a mídia congelar por epitélio e alíquota sobre 1ml em criotubos. Isto pode ser armazenado a 4 ° C por até seis meses até ser necessário. Congelamento de mídia contém DMEM/F12 media tamponado com HEPES e NaHCO _3, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de dimetil sulfóxido (DMSO).

Colheita epitélio mamário de um rato recentemente sacrificados feminino.

1. Lavar o mouse com EtOH 70%.
2. Faça um corte médio-sagital através da parede do corpo que se estende do púbis ao esterno sem perfurar a membrana serosa da cavidade do corpo ventral. Faça um corte oblíquo da incisão inicial no púbis em direção à perna (Figura 1).
3. Descasque a parede do corpo longe da serosas para expor a 5 ^ª glândula mamária inguinal presos na fáscia sobre a parte inferior da parede do corpo. A melhor maneira de conseguir isto é agarrar as membranas serosas cuidado com a porção curvada de um par de fórceps curvos, tomando cuidado para não perfurar a cavidade do corpo ventral. Simultaneamente, segure a borda do corte do tegumento com uma pinça reta serrilhada e puxe a parede do corpo de distância da membrana serosa.
4. Identificar o linfonodo dentro da glândula mamária. Linfonodo está localizado na intersecção de três vasos sangüíneos proeminentes na glândula mamária e pode ser sentida como um nódulo denso dentro do bloco de gordura (Figura 2). Com a ponta de uma tesoura olho, o tecido adiposo em torno cortar o nó. Com um dedo frente no lado epidérmico da pele, aplicar uma pressão para aumentar a saída do nó da gordura abdominal e comprima-o com um par de pinças curvas. Descartar o nó de linfa.
5. , Mantendo as margens da pele, segure a almofada de gordura mamária com a borda curvada de um par de pinças curvas e, gradualmente, a almofada de gordura casca de distância da parede do corpo. Siga a direção da gordura abdominal para a superfície dorsal do rato como você remover toda a glândula mamária em uma única peça.
6. Coloque a glândula mamária em um bloco de plástico estéril de corte. Adicionar uma pequena quantidade de media, cerca de 200 mL, para a superfície da glândula para mantê-lo úmido. Picar a glândula em pedaços 1 milímetro com uma lâmina de barbear fresco. Divide a glândula picada em quatro partes e distribua entre quatro criotubos de mídia congelar com uma pinça. Coloque o criotubos em um "Mr. Frosty Nalgene freezer célula que tem 250ml de álcool isopropílico no compartimento exterior. Coloque no congelador Nalgene em um freezer -70 ° C por 24 horas. Loja frascos de fragmentos congelados em nitrogênio líquido mamário até ser necessário para transplante. Cada cryovial irá conter fragmentos das glândulas mamárias para transplante o suficiente para as almofadas limpas de gordura de 4-8 camundongos host.

2. Preparação das células de Transplante

Nosso laboratório tem transplantado tipos de células diferentes, incluindo imortalizado mamárias linhagens de células epiteliais, mamárias linhagens de células tumorais ou células primárias de mama em um mouse pad limpo de gordura. O protocolo para a preparação de Comma-D células para transplante é a seguinte:

1. Comma-D células são cultivadas em meios regulares MECL contendo DMEM: F12 suplementado com 2% soro de bovino adulto (ABS), mEGF, insulina, antibiótico / antimicótico (AB / AM).
2. Colheita Comma D-células quando as células são 85% -90% confluentes.
3. Centrifugar a suspensão de células em 1200rpm por 5 minutos para sedimentar as células. Ressuspender as células em novas mídias MECL e ajustar a concentração de células de 5 x 10 ⁶ / ml.

Para o transplante de células primárias de mama, a principal células epiteliais mamárias são isolados de rato 5 ^º glândulas mamárias através da dissociação mecânica e enzimática. Células são ressuspendidas em DMEM: F12 mídia e ajustado para a concentração desejada, geralmente 5 x 10 ⁶ / ml.

3. Procedimento padrão para Limpar o Mouse Pad mamária Fat

1. Anestesiar a três semanas do mouse host antigo. Selecione os ratos que são <12 g para garantir que o crescimento ductal mamária não foi iniciada. Usamos 200mg/kg de peso corporal de 2,2,2 tribromoetanol.
2. Depois que o mouse está anestesiado, firmemente conter o mouse, lado ventral com os braços estendidos, em um estágio cirúrgico para que o abdômen é provocação. Antes da cirurgia, administrar analgésicos; ou bupivacaína (1mg/kg <) ou buprenorfina (0.05mg/kg), por via subcutânea.
3. Segure a pele com uma pinça alguns milímetros acima da pélvis e levante-o do abdômen . Nip a pele com uma tesoura e fazer um corte médio-sagital através da parede do corpo que se estende do púbis ao esterno. Não furar as membranas serosas da cavidade do corpo ventral. Não faça sua incisão inicial muito perto da uretra de modo que grampos de sutura não irá interferir com a capacidade dos camundongos para urinar.
4. Da incisão inicial, fazer cortes oblíquos através da pele a partir de meados-line através da pelve para cada perna.
5. Use a área de curvas do fórceps curvas para agarrar o delicadamente membranas serosas. Use uma pinça para agarrar a margem de corte da pele e puxe a parede do corpo longe da serosas e expor a 5 ^ª glândula mamária inguinal localizado na fáscia sobre a parte inferior da parede do corpo.
6. Cauterizar o mamilo nó, e duas artérias que conduzem ao nó (Figura 2)
7. Separe as glândulas quarto e quinto. Cauterizar a margem da glândula quinta para evitar ingrowth da glândula 6 ^º.
8. Divide a almofada de gordura na glândula mamária por quarto cortando a almofada de gordura com uma tesoura apenas ventral (lado para o mamilo) do nó. Use pinças curvas para agarrar firme a porção ventral da gordura abdominal e puxe-o para longe da parede do corpo em uma só peça. Pressione a porção ventral da almofada de gordura entre dois slides e colocar em um prato de vidro coloração histologia contendo fixador de Carnoy. Este tecido será fixado e corado posteriormente com solução de carmim alum para verificar se as margens limpas (Figura 3). Limpe a fascia em torno da região da porção removida do bloco de gordura para remover todos os vestígios da glândula mamária com o fórceps curvos.

4. Procedimento "alternativa Sparing para Limpar a gordura abdominal

Depois tornou-se um competente com o procedimento padrão para limpar o mouse pad mamárias de gordura, eles podem preferir tentar poupar o procedimento menos invasivo desenvolvido por Brill et al. (2008) ^2.

1. Prepare o mouse como para o procedimento padrão.
2. Segure o mamilo da glândula mamária inguinal quarto e cortar um círculo de circunferência de 3-5 mm em torno do mamilo com a ponta da tesoura.
3. Puxar o mamilo para fora do corpo para separar a parte cortada da pele e tirar a glândula mamária inguinal quarto para fora através do furo.
4. Identificar o nó. Use o cautério para cauterizar o nó ea glândula mamária 6 ^º pelo buraco.
5. Corte e retire a parte mais superficial da glândula mamária 5 ^º, antes do nó. O mamilo área circular de pele e parte do epitélio mamário de gordura contendo pad são removidos em uma única peça.

5. Tecido / Cell Transplantation

1. Para fragmentos de epitélio transplante, degelo cryovial um do epitélio e transferir os restos epiteliais de uma placa de Petri contendo meio fresco para diluir o DMSO. Faça um pequeno furo ou no bolso no bloco limpo de gordura com a ponta tesoura para o novo epitélio. Coloque um pedaço um milímetro do epitélio do doador para o bolso com uma pinça agulha. Segure o bolso fechado com uma pinça como você retirar a pinça agulha de modo que o tecido permanece no local.
2. Para as células do transplante, injetar 50.000 células em 10 ml de mídia em cada almofada de gordura, utilizando uma seringa Hamilton 50μl com uma agulha de calibre 22s.

6. Fechamento / Revival of Mouse

1. Organizar a pele para o fechamento. Segure margens opostas da pele, mantê-los juntos com uma pinça, levantá-los longe das membranas serosas da cavidade do corpo ventral e fechar com clips ferida. Normalmente, é necessário usar dois clips para fechar a incisão médio-sagital e um clip para cada incisão oblíqua para o procedimento padrão. Evitar a obstrução da uretra. Pode ser necessário para fechar as lacunas na pele, na intersecção das incisões médio-sagital e oblíqua com uma sutura. O procedimento poupador irá necessitar apenas de um clipe de feridas para cada lado.
2. . Posicione o mouse em sua gaiola e manter a gaiola sob uma lâmpada de aquecimento até que o mouse tem revivido.
3. Os grampos de sutura deve ser removida após 2 semanas.

Figura 1. Demonstração do padrão de incisão.

Figura 2. Localização do nó de linfa, vasos sanguíneos, mamilo e epitélio endógena. Cauterize em locais indicados.

Figura 3. Montar Whole demonstra que o epitélio endógena é restrita à área dentro do círculo e, portanto, as margens são "claros".

7. Resultados representante

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Figura 4. Whole montagem de almofada de gordura removida do mouse de 3 semanas de idade mostrando margens limpas.

Figura 5. Whole montagem de um rato de 10 semanas de idade mostrando almofada de gordura livre de epitélio mamário endógena.

Figura 6. Hematoxilina e eosina seção manchada de uma almofada limpa de gordura de um mouse de 10 semanas de idade.

Figura 7. Whole montagem de um rato de 10 semanas de idade mostrando árvore ductal mamário normal desenvolvido a partir do epitélio transplantado.

Figura 8. Hematoxilina e eosina seção manchada de ductos mamários desenvolvido a partir do epitélio transplantado.

Figura 9. Hematoxilina e eosina seção manchada de um tumor mamário desenvolvido a partir do epitélio transplantado.

Discussion

Neste relatório, apresentamos dois métodos alternativos para limpar o mouse pad mamárias de gordura na preparação para transplantes mamárias epiteliais. O procedimento padrão tem sido em uso desde o seu desenvolvimento em 1959 por DeOme et al. ¹ Enquanto mais invasivo, o método padrão é o método preferido para treinar o novato porque a estrutura e orientação da glândula mamária são facilmente visualizadas. No entanto, o procedimento poupador pode ser preferido pelo cirurgião mais experiente por causa de várias vantagens ^2. Mais importante ainda, o procedimento é menos invasivo poupando, requer menos tempo e pode ser realizada através de um breve período de anestesia inalatória. Isso reduz o período de recuperação para o mouse. O procedimento poupando também pode ser realizado em ratos mais jovens (<21 dias) garantindo sucesso depuração do epitélio. Além disso, há uma redução de aderência do tecido após a cirurgia que pode ser vantajoso se repetir experimentos requerem cirurgia para remover tumores primários, mas permitem a observação a longo prazo continuado do mouse para metástase.

A parte do procedimento de transplante aproveita do fato de que o pleno desenvolvimento da glândula mamária não ocorre até depois da puberdade. Remoção prévia da pequena parcela da almofada de gordura contendo o epitélio endógeno "limpa" o bloco restante de gordura do rato jovem e elimina o potencial para o desenvolvimento de árvores epitelial ductal. Epitélio experimental pode ser transplantado para a almofada limpa de gordura do mouse acolhimento e avaliação das conseqüências resultantes podem ser feitas sem os efeitos de confusão do epitélio anfitrião endógena. Portanto, este procedimento é útil para avaliar a capacidade de células epiteliais mamárias para desenvolver in vivo.