Summary
В этой статье показано процедура разработана DeOme КБ
Abstract
В этой статье описываются и сравниваются жира процедура оформления площадки разработанный КБ DeOme и соавт. 1 и щадящие процедуры разработаны Брилл В соавт. 2, а затем молочной эпителиальных процедуры трансплантации. Молочных процедуры трансплантации широко используется молочной биологов, поскольку она использует в своих интересах тот факт, что значительное развитие молочных эпителия происходит только после полового созревания. В 3-недельного возраста, роста молочных эпителиальных дерева ограничивается близости от соска и жировой ткани в значительной степени лишенные эпителия молочной, но на 7-недельного возраста эпителия протоков дерева простирается по всей жировой ткани. Поэтому, если это небольшая часть жировой ткани содержащие эпителия, область между соском и лимфатических узлов, удаляется на 3-недельного возраста, эндогенные эпителия никогда не будет заполнить молочной жировой ткани и жировой ткани описывается как "очищаются ». В это время, молочной эпителия из другого источника могут быть пересажены в очищенном жировой ткани, где она имеет потенциал для расширения протоков молочных деревьев путем из жировой ткани. Эта процедура была использована во многих экспериментальных моделей, включая рассмотрение опухоли фенотипа у трансгенных молочных эпителиальные ткани без смешанные эффекты генотипа на весь животный 3, в идентификации стволовых клеток молочной железы путем пересадки клеток в ограниченном разбавления 4,5, определяющих если гиперпластические узелки приступить к опухоли молочной железы 6, а также для оценки влияния предварительного воздействия гормона на поведение молочных эпителия 7,8.
Три недели старых мышей хоста под наркозом, очищено и сдержанный на хирургический этап. Середине сагиттальной разрез делается через кожу, но не брюшины, простирающейся от лобка до грудины. Наклонные разрезы производятся через кожу от середины сагиттальной разрез через таз к каждой ноге. Кожа оторвался от брюшины подвергать 4-й паховых молочной железы. Жировая ткань удаляется путем удаления жира передней ткани площадку для лимфатических узлов. Эпителий фрагменты или эпителиальные клетки пересаживают в оставшейся жировой ткани очищаются и мыши закрыт.
Protocol
1. Подготовка трансплантации Эпителий
Свежие или замороженные доноров эпителиальной ткани можно пересаживать в очищается жировой ткани, но предварительная подготовка замороженных эпителия донором является более удобным с минимальным снижением эффективности трансплантации (> 85% эффективности). Протокол для подготовки замороженных эпителия доноров выглядит следующим образом:
Перед приготовлением эпителия доноров трансплантации, подготовить замораживание средств массовой информации для эпителия и аликвоту около 1 мл в криопробирки. Это можно хранить при температуре 4 ° С в течение 6 месяцев, пока это необходимо. Замораживание средств массовой информации содержит DMEM/F12 СМИ с буфером HEPES и NaHCO 3, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 10% диметилсульфоксида (ДМСО).
Урожай молочной эпителий от недавно эвтаназии женщины мыши.
- Мойте мышь с 70% этанола.
- Сделать середине сагиттальной прорезать стенки тела простирается от лобка до грудины без пирсинга серозных оболочек брюшной полости тела. Сделать косым срезом от начальной разрез на лобке по отношению друг к задней ноге (рис. 1).
- Пил стенки тела от серозных оболочек подвергать 5-й паховых молочных желез придает фасции на нижней стенки тела. Лучшим способом достижения этого является, держа серозных оболочек тщательно с изогнутой части парой изогнутых щипцов, стараясь не проколоть вентральной полости тела. Одновременно, держитесь вырезать края покровов с прямыми пинцетом и вытащить зубчатые стенки тела от серозных оболочек.
- Определить лимфатических узлов в молочной железе. Лимфатический узел расположен на пересечении трех известных кровеносных сосудов в молочной железе и может ощущаться в виде плотного узелка в жировой ткани (рис. 2). С кончика пара глаз ножницы, пресечь жировой ткани, окружающие узел. С передних пальца на эпидермальный стороны кожи, оказывают давление поднять узел из жировой ткани и щепотку его с парой изогнутых щипцов. Откажитесь от лимфатических узлов.
- Удерживая края кожи, держитесь молочной жировой ткани с изогнутыми краю пару изогнутых щипцов и постепенно кожуры жировой ткани от стенки тела. Следуйте направлению жировой комок к дорсальной поверхности мыши, как вы удалите весь молочной железы в одной части.
- Положите молочной железы на стерильном блоке резки пластика. Добавьте небольшое количество средств массовой информации, около 200 мкл, на поверхности железы держать его влажным. Фарш железы на куски 1 мм с новым лезвием. Разделить фарш железы на четыре части и распределить между четырьмя криопробирки замораживания средств массовой информации щипцами. Положите криопробирки в Nalgene "г-н Морозный морозильник клетки, которая имеет 250 мл изопропилового спирта в наружном отсеке. Поместите морозильник Nalgene в морозильной камере -70 ° C в течение 24 часов. Хранить замороженные флаконы молочных фрагментов в жидком азоте до необходимого для трансплантации. Каждая криопробирку будет содержать достаточно молочной железы фрагменты, чтобы пересадить в жировые отложения очищаются от 4 до 8 мышей хоста.
2. Подготовка трансплантации клетки
Наша лаборатория пересаженных клеток разных типов, в том числе молочных увековечены эпителиальных клеточных линий, молочных опухолевых клеточных линий или первичных клеток молочной железы в мышь очищается жировой ткани. Протокол для подготовки Comma-D клеток для трансплантации заключается в следующем:
- Запятая-D клетки культивируют в регулярных MECL средах, содержащих DMEM: F12 с добавлением 2% взрослого бычьего сывороточного (ABS), mEGF, инсулина, антибиотиков / противогрибковым (AB / AM).
- Урожай Comma-D клеток, когда клетки 85% -90% вырожденная.
- Центрифуга клеточной суспензии на 1200rpm в течение 5 минут для осаждения клеток. Ресуспендируют клеток в свежей MECL средств массовой информации и корректировать концентрацию клеток до 5 х 10 6 / мл.
Для трансплантации первичных клеток молочной железы, молочных первичных эпителиальных клеток изолированы от мыши 5-й молочных желез с помощью механических и ферментативной диссоциации. Клетки ресуспендировали в DMEM: F12 СМИ и доводят до нужной концентрации, как правило, 5 х 10 6 / мл.
3. Стандартная процедура очистки молочной железы мыши жировой ткани
- Обезболить три недели старая мышь хост. Выберите мышей, <12 г, чтобы молочных протоков роста не было возбуждено. Мы используем 200mg/kg массы тела 2,2,2-tribromoethanol.
- После мышь под наркозом, прочно удерживать мышь, брюшная сторона с протянутой конечностей, на хирургическом этапе, с тем, что живот дразнить. До операции, управлять анальгетиков: либо бупивакаин (<1мг/кг) или бупренорфин (0.05mg/kg), подкожно.
- Возьмитесь за кожу щипцами несколько миллиметров выше таза и поднимите его из брюшной полости . Nip кожи с помощью ножниц и сделать в середине сагиттальной прорезать стенки тела простирается от лобка до грудины. Не прокалывать серозных оболочек брюшной полости тела. Не делайте ваш первоначальный разрез слишком близко к уретре, чтобы рана клипов не будет вмешиваться в способность мыши к мочеиспусканию.
- Из начального разреза, сделайте косой прорезает кожу от средней линии через таз по отношению друг к задней ноге.
- Используйте изогнутые области изогнутых щипцов, чтобы мягко понять серозных оболочек. Использование ткани щипцы понять сократить маржу кожи и вытащить тело стенку от серозных оболочек и выставить 5-й паховых молочных желез расположены на лицевой панели в нижней части стенки тела.
- Cauterize соска, узлов и две артерии, ведущие к узлу (рис. 2)
- Отдельные четвертого и пятого желез. Cauterize краю пятого железы, чтобы предотвратить врастание с 6-го железы.
- Разделите жировая ткань четвертого молочной железы за счет сокращения через жировой ткани с помощью ножниц только вентральной (стороны к соску) узла. Используйте пинцет изогнутый твердо усвоить брюшной части жировой ткани и потяните ее от стенки тела в одной части. Пресс брюшной части жировой ткани между двумя предметными стеклами и поставить в окрашивания стекла гистологии блюдо с фиксатором Карнуа. Эта ткань будет фиксировали и окрашивали позже с раствором квасцов кармин для проверки очищены поля (рис. 3). Чистая фасции вокруг области удалена часть жировой ткани, чтобы удалить все следы молочной железы с изогнутым пинцетом.
4. Альтернатива "Щадящая процедура очистки жира Pad
После одного стал компетентным со стандартной процедурой для очистки молочной железы мыши жировой ткани, они могут предпочесть попытку менее инвазивные процедуры щадящий разработан Brill и соавт. (2008) 2.
- Подготовьте мышь, как для стандартной процедурой.
- Возьмитесь за сосок четвертого паховых молочных желез и сократить 3-5 мм окружности круга вокруг соска кончиком ножниц.
- Вытяните сосок от тела отделить вырезать часть кожи и сделать четвертый паховых молочных желез через отверстия.
- Определить узел. Используйте прижигания прижечь узлов и 6-й молочную железу через отверстие.
- Вырезать и отделить наиболее поверхностные части 5-й молочной железы перед узлом. Соска, циркулярный участок кожи и часть молочной жировой ткани содержащие эпителия, удаляются в одной части.
5. Ткань / клеточной трансплантации
- Для пересадки фрагментов эпителия, размораживание криопробирку эпителия и передачи эпителиальных фрагментов чашки Петри со свежими средств массовой информации для разбавления из ДМСО. Сделайте небольшое отверстие или в кармане, в очищен жировой ткани с ножницами наконечник для нового эпителия. Положите кусок 1мм донорских эпителия в карман с иглой щипцами. Держите карман закрыта с тканью щипцы, как вы снять иглу пинцетом так ткань остается на месте.
- Для пересадки клеток, вводят 50 000 клеток в 10 мкл среды в каждой жировой ткани использовании шприца 50 мкл Гамильтона с иглой 22s.
6. Закрытие / Возрождение мышь
- Упорядочить кожи для закрытия. Возьмитесь противоположных краев кожи, держать их вместе с пинцетом, поднимите их от серозных оболочек брюшной полости и закрыть рану с клипами. Как правило, необходимо использовать два клипа, чтобы закрыть середину сагиттальной разрез и один клип для каждого косой разрез по стандартной процедуре. Избегайте препятствий уретры. Это может быть необходимо, чтобы закрыть пробелы в кожу на пересечении середины сагиттальной и косой разрез с швом. Щадящая процедура требуется только одна рана клипа для каждой стороны.
- . Наведите в ее клетке и держать клетку под лампу нагрева, пока мышь ожила.
- Раны клипы должны быть удалены через 2 недели.
Рисунок 1. Демонстрация разрез картины.
Рисунок 2. Расположение лимфатических узлов, кровеносных сосудов, соски и эндогенных эпителия. Cauterize в местах, указанных.
Рисунок 3. Целые горы демонстрирует, что эндогенные эпителия ограничена площадь внутри круга, и поэтому маржа "ясно".
7. Представитель Результаты
_r.jpg "ALT =" Рисунок 4 "/>
Рисунок 4. Целые горы удален жировой ткани от 3-недельных мышей показывает очистили поля.
Рисунок 5. Всего смонтировать 10 недель старая мышь показывает жировой ткани очищаются от эндогенных молочной эпителия.
Рисунок 6. Гематоксилин-эозином окрашенные части очистили жировой ткани от 10 неделя мыши.
Рисунок 7. Всего смонтировать 10 недель старая мышь показывает нормальную молочных протоков дерево разработана из пересаженных эпителия.
Рисунок 8. Гематоксилин-эозином окрашенных разделе молочных протоков развитой из пересаженных эпителия.
Рисунок 9. Гематоксилин-эозином окрашенные части опухоли молочной железы разработана из пересаженных эпителия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данном отчете мы представляем два альтернативных метода для очистки молочной железы мыши жировой ткани в рамках подготовки к молочной эпителиальных трансплантации. Стандартная процедура была в использовании, поскольку ее развитие в 1959 году DeOme и соавт. 1 При более агрессивными, стандартный метод является предпочтительным методом для обучения начинающих, так как структура и направленность молочной железы просматриваются. Тем не менее, щадящая процедура может быть предпочтение более опытным хирургом из-за несколько преимуществ 2. Самое главное, щадящая процедура менее инвазивным, требует меньше времени и может выполняться с использованием короткого периода ингаляционной анестезии. Это сокращает период восстановления для мыши. Щадящая процедура также может быть выполнена на более молодых мышей (<21 дней) обеспечение успешного оформления эпителия. Кроме того, происходит снижение адгезии тканей после операции, которая может быть выгодно, если эксперименты требуют повторить операцию по удалению первичной опухоли, однако позволяют продолжения долгосрочного наблюдения мышь для метастазирования.
Пересадка части процедуры использует тот факт, что полное развитие молочной железы происходит только после полового созревания. Перед удалением небольшая часть жировой ткани содержащие эндогенные эпителия "очищает" оставшиеся жировой ткани молодых мышей и устраняет потенциал для развития эпителиальных протоков деревьев. Экспериментальные эпителия могут быть пересажены в жировой ткани очищаются от мыши хост и оценки в результате наросты могут быть сделаны без смешанные эффекты эндогенных эпителия хозяина. Таким образом, эта процедура полезна для оценки потенциала молочной эпителиальных клеток развиваться в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
- Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).
- Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).
- Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
- Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439, 993-997 (2006).
- Medina, D. Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer. Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).
- Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal. Development. 129, 1377-1386 (2002).
- Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice. Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).
