Summary
Bu makale DeOme KB tarafından geliştirilen yöntemle gösterir
Abstract
Bu makalede anlatılan ve DeOme KB ve ark tarafından geliştirilen yağ yastığı izni prosedürü karşılaştırır 1 Brill Yatak ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve tutucu bir prosedür. 2, meme epitel nakli prosedürünün izledi . Ergenlik sonrasına kadar meme epitel önemli bir gelişme meydana gelmeyeceği gerçeğinin yararlanır çünkü meme nakli prosedürünün çok meme biyologlar tarafından kullanılır. 3 hafta yaş, meme epitel ağacının büyüme, meme başının çevresinde sınırlıdır ve yağ yastığı meme epitel büyük ölçüde yoksun, ancak yaşı 7 hafta epitel duktal ağaç tüm yağ yastığı boyunca uzanır. Bu nedenle, yağ yastığı epitel içeren bu küçük bir kısmını, meme ve lenf nodu arasındaki bölge, yaş 3 hafta kaldırılması durumunda, endojen epitel meme yağ yastık doldurmak asla ve yağ yastığı "temizlenmiş olarak tanımlanır ". Bu zamanda, başka bir kaynaktan meme epitel yağ yastığı boyunca meme duktal ağaçları artırma potansiyeline sahiptir temizlenmiş yağ yastığı transplante edilebilir. Bu prosedür 4,5 sınırlı seyreltme hücre nakli tarafından belirlenmesi, meme kök hücrelerin belirlenmesinde, transgenik meme epitel doku tümör fenotip genotip karıştırıcı etkisi olmadan tüm hayvan 3 incelenmesi de dahil olmak üzere pek çok deneysel modellerde kullanılan olmuştur hiperplastik nodüller meme tümörlerinde 6 ilerlemek ve meme epitel 7,8 davranışı önceden hormon maruz kalmanın etkisini değerlendirmek.
Üç haftalık ana fareler, anestezi, cerrahi bir sahnede temizlenmeli ve ölçülü. Mid-sagital bir kesi, deri yoluyla yapılmış, ancak değil, periton, pubis sternum uzanan. Eğik keser Her bacak doğru pelvis boyunca mid-sagital kesi deri yoluyla yapılır. Cilt 4. inguinal meme bezi maruz periton uzak çekilir. Yağ yastığı, lenf nodu, yağ ped doku anterior kaldırarak temizlenir. Epitel parçaları veya epitel hücreleri temizlendi kalan yağ yastığı içine nakledilen ve fare kapalıdır.
Protocol
1. Nakli Epitel hazırlanması
Taze ya da dondurulmuş donör epitel doku temizlenir yağ yastığı içine nakledilen, ama dondurulmuş donör epitelin ön hazırlık nakli verimlilik minimal azalma (>% 85 verimlilik) ile daha rahat olabilir. Dondurulmuş donör epitelin hazırlanması için protokol aşağıdaki gibi:
Donör nakli epitel hazırlamadan önce, cryovials içine 1ml hakkında epitel ve kısım için dondurma medya hazırlar. Gerektiği kadar bu 4 ° C'de 6 ay kadar saklanabilir. Freeze medya, Hepes ve NaHCO 3,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 dimetil sulphoxide (DMSO) ile tampon DMEM/F12 medya içerir .
Kısa bir süre önce ötenazi dişi fare meme epitel Hasat.
- Fare,% 70 EtOH ile yıkayın.
- Ventral vücut boşluğunda seröz membranlar piercing vücut duvarı ile pubis sternum kadar uzanan bir mid-sagital kesim olun. Her arka bacak (Şekil 1) doğru pubis başlangıç kesi oblik bir kesim olun.
- Vücut duvarının alt kısmında fasya bağlı 5. inguinal meme bezi maruz seröz membranlar uzak vücut duvarı soyun. Bunu başarmak için en iyi şekilde delmek ventral vücut boşluğuna değil dikkatli olmak, seröz membranlar kavisli bir forseps bir çift kavisli bölümünü dikkatlice tutarak. Aynı zamanda, kesme kenarı düz dişli forseps ile kabuklarıyla kavramak ve vücut duvarı seröz membranlar uzak çekin.
- Meme bezi içindeki lenf nodu belirleyin. Lenf nodu meme bezi üç önemli kan damarlarının kesişme noktasında yer alır ve yağ yastığı (Şekil 2) içinde yoğun bir nodül olarak hissedilebilir. Ucu ile bir çift göz makas, nip düğüm çevreleyen yağ dokusu. Baş parmak ile cildin epidermal tarafında bir yağ yastığı düğüm dışarı yükseltmek ve bir çift kavisli bir forseps ile çimdik basınç uygulanır. Lenf düğümü atın.
- Cilt kenar boşluklarını tutarken, kavisli kenarı kavisli bir forseps bir çift ve yavaş yavaş yağ yastığı vücut duvarı uzak kabuğu meme yağ yastığı kavramak. Tek parça olarak tüm meme bezi kaldırmak olarak fare dorsal yüzeyine doğru yağ yastığı yönde uygulayın.
- Meme bezi steril bir plastik kesme blok üzerine koyun. Bezinin yüzeyi nemli tutmak için, 200 ul hakkında, medya küçük bir miktar ekleyin. 1mm parçalar halinde taze bir jilet ile bezi Kıyma. Kıyılmış bezi dört parçaya bölün ve forseps ile dondurma medya dört cryovials arasında dağıtmak. Dış izopropil alkol 250ml bir Nalgene "Mr Frosty hücre dondurucu cryovials koyun. Nalgene dondurucuda -70 ° C derin dondurucuda 24 saat koyun. Kadar gerekli, sıvı nitrojen içinde meme parçalarının dondurulmuş şişeleri Mağaza nakli. Her cryovial 4-8 ev sahibi farelerin yağ pedleri temizlenir nakli için yeterli meme bezi parçaları içerecektir.
2. Nakli Hücreler hazırlanması
Laboratuar ölümsüzleştirdi meme epitel hücre hatları, meme tümör hücre hatları veya bir fare içine primer meme hücrelerinin yağ yastığı temizledi dahil olmak üzere farklı hücre tipleri, nakledilen vardır. Virgülle D transplantasyon için hücrelerin hazırlanması için protokol aşağıdaki gibi:
- Virgülle D hücreleri DMEM içeren düzenli MECL medya kültürü: F12,% 2 Yetişkin Sığır Serum (ABS), mEGF, İnsülin, antimikotik / Antibiyotik (AB / AM) ile desteklenmiş.
- Hasat Virgülle D hücreleri hücrelerin 85% -90% konfluent.
- 5 dakika boyunca pelet hücreleri hücre süspansiyon 1200rpm santrifüjleyin. Taze MECL medya hücrelerinin yeniden süspanse edin ve 5 x 10 6 / ml hücre konsantrasyonunu ayarlamak.
Primer meme hücrelerinin nakli için, birincil meme epitel hücreleri, fare 5. meme bezlerinin mekanik ve enzimatik dissosiasyon yolu ile izole edilmiştir . F12 medya ve istenen konsantrasyona göre ayarlanır, genellikle 5 x 10 6 / ml: Hücreler DMEM yeniden süspanse edilir.
3. Fare Meme Fat Pad temizlemek için Standart Yöntem
- Üç hafta eski konak fare anestezisi. Duktal meme büyümesi başlatılan olmamıştır sağlamak için <12 g fareler seçin. Biz 2,2,2-tribromoethanol vücut ağırlığının 200mg/kg kullanın.
- Fare uyuşturulduktan sonra karın alay böylece cerrahi bir sahnede sıkıca uzanmış uzuvları ile, ventral tarafta fare dizginlemek. Ameliyat öncesinde, analjezikler yönetmek; bupivakain (<1mg/kg) veya buprenorfin (0.05mg/kg), subkutan.
- Pelvis birkaç milimetre yukarıda forseps ile cilt kavrayın ve karından yukarı kaldırın . Nip makas ile cilt ve vücut duvarı ile pubis sternum kadar uzanan bir mid-sagital kesim yapmak. Delmek ventral vücut boşluğunda seröz membranlar etmeyin. Yara klipleri fare idrara çıkma yeteneği engel olmaz böylece ilk kesi çok üretra yakın yapmayın.
- Ilk kesi, her arka bacak doğru pelvis boyunca orta hat cilt yoluyla eğik kesikler yapın.
- Yavaşça seröz membranlar kavramak için kavisli bir forseps kavisli alanını kullanın. Deri kesme marjı kavramak ve seröz membranlar uzak vücut duvarı çekin ve vücut duvarının alt kısmında ön panoda bulunan 5 inci inguinal meme bezi maruz doku forseps kullanın.
- Meme, düğüm ve düğüm (Şekil 2) önde gelen iki arter dağlamak
- Dördüncü ve beşinci bezleri ayırın. 6. bezi büyümesinin önlemek için beşinci bezinin marjı dağlamak.
- Düğümün (meme karşı tarafı) sadece ventral makas ile yağ yastığı kesen dördüncü meme bezinin yağ yastığı bölün. Kavisli bir forseps yağ yastığı ventral kısmı sıkıca kavrayın ve tek parça olarak vücut duvarı uzağa çekmek için kullanın. Iki slaytlar arasındaki yağ yastığı ventral kısmı basın ve Carnoy Kullanıcı fiksatif içeren bir cam histoloji boyama çanak koymak. Bu doku, sabit ve daha sonra karmin şap çözüm temizlenir marjları (Şekil 3) kontrol etmek için boyanmış olacaktır. Fasya kaldırılan kısmı kavisli bir forseps ile meme bezinin tüm izlerini silmek için yağ yastığı bölgesi etrafında temizleyin.
4. Fat Pad Takas için alternatif "Ayırma Prosedürü
Bir fare meme yağ yastığı temizleme için standart bir prosedür ile yetkili haline gelmiştir sonra, onlar daha az invaziv bir koruyucu prosedür Brill ve ark (2008) 2 tarafından geliştirilen girişimi için tercih edebilirsiniz.
- Standart prosedür olarak fare hazırlayın.
- Dördüncü inguinal meme bezi meme kavramak ve makas ucu ile meme başı etrafında 3-5 mm çevresi daire kesmek.
- Deri kesme kısmını ayırmak dördüncü inguinal meme bezi ve delikten dışarı çekmek için vücuttan meme çekin.
- Düğüm tanımlayın. Delikten düğüm ve 6 ncı meme bezi dağlamak için koter kullanın.
- 5. meme bezinin düğümün hemen önce en yüzeysel kısmı kesin ve kesin. Meme, cilt ve meme yağ pedi içeren epitel bölümünü dairesel alanda tek parça halinde çıkarılır.
5. Doku / Hücre Transplantasyonu
- Epitel parçaları nakli için, defrost epitel cryovial ve DMSO sulandırmak için taze medya içeren bir Petri kabı epitel parçaları transfer. Yeni epitel makas ucu ile temizlenir yağ yastığı küçük bir delik veya cep olun. Iğne forseps ile cebine donör epitelin 1mm parçası koyun. Cep doku yerinde kalır, böylece iğne forseps geri doku forseps ile kapalı tutun.
- Hücrelerin nakli için, her bir yağ yastığı içine 22s iğne ile 50μl Hamilton şırınga kullanarak medya 10 ul 50.000 hücreleri enjekte edilir.
6. Kapanış / Mouse Revival
- Cilt kapatılması için düzenleyin. Cilt marjları karşı tutun, forseps ile onları bir arada tutmak ventral vücut boşluğunda seröz membranlar onları kaldırarak ve yara klipleri ile yakın. Genellikle, mid-sagital insizyon ve standart prosedür için her oblik kesi için tek bir klibin kapatmak için iki klipleri kullanmak için gereklidir. Üretra engellemekten kaçının. Bu, bir dikiş ile orta sagital ve oblik insizyon kesiştiği cilt açıklarını kapatmak için gerekli olabilir. Koruyucu prosedürü her iki tarafı için sadece bir yara klip gerekecektir.
- . Onu kafese yerleştirin ve fare fare gündeme getirdi kadar kafes bir ısıtma lambası altında tutmak.
- Yara klipler, 2 hafta sonra çıkarılmalıdır.
Şekil 1 kesi desen gösterilmesi.
Şekil 2 lenf nodu, kan damarları, meme ve endojen epitel yeri. Yerlerinde belirtilen dağlamak.
Şekil 3. Tüm montaj, bu endojen epitel daire içinde alan ile sınırlı ve bu nedenle marjları "açık 'gösteriyor .
7. Temsilcisi Sonuçlar
_r.jpg "alt =" Şekil 4 "/>
Şekil 4 Tüm montaj temizlenir marjları gösteren 3 haftalık fare kaldırılır yağ yastığı.
Şekil 5 Tüm montaj gösteren bir yağ yastığı endojen meme epitel temizlenir 10 haftalık fare.
Şekil 6 Hematoksilen ve eosin ile boyanan bölümünde, 10 haftalık fare bir temizlenmiş yağ yastığı .
Şekil 7 nakledilen epitel geliştirilen normal meme duktal ağaç gösteren bir 10 haftalık fare Tüm montaj.
Şekil 8 Hematoksilen ve eosin ile boyanan bölümünde nakledilen epitel geliştirilen meme kanalları.
Şekil 9 Hematoksilen ve eosin ile boyanan bölümünde nakledilen epitel geliştirilen bir meme tümörü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu raporda, meme epitel nakli için hazırlık fare meme yağ yastığı temizlenmesi için iki alternatif yöntemler sunuyoruz. Standart prosedür DeOme ve arkadaşları tarafından 1959 yılında gelişimi beri kullanımda olan 1 daha invaziv meme bezinin yapısı ve yönünü kolayca ederken görülüyor, çünkü acemi eğitimi için standart bir yöntem tercih edilen bir yöntemdir. Ancak, koruyucu prosedür, çeşitli avantajları 2 nedeniyle daha deneyimli bir cerrah tarafından tercih edilebilir. En önemlisi, koruyucu prosedür daha az invaziv, daha az zaman gerektirir ve kısa bir süre inhalasyon anestezi ile yapılabilir. Bu fare için iyileşme dönemi azaltır. Koruyucu prosedür de epitel başarılı açıklık sağlanması genç farelerde (<21 gün) yapılabilir. Buna ek olarak, deneyler, henüz metastaz için fare devam eden uzun vadeli bir gözlem için izin, primer tümör kaldırmak için tekrar ameliyat gerektiriyorsa avantajlı olabilir cerrahi sonrası adezyon bir azalma vardır.
Prosedürün nakli kısmı meme bezinin tam gelişmesi ergenlik sonrasına kadar ortaya çıkmaz gerçeği yararlanır. Endojen epitel içeren yağ yastığı küçük bir bölümünü önceden çıkarılması genç bir fare kalan yağ pad "temizler" ve epitel duktal ağaçların gelişmesi için potansiyeli ortadan kaldırır. Deneysel epitel endojen konak epitel karıştırıcı etkileri olmadan yapılabilir ana fare ve değerlendirilmesi sonucunda çıkıntılar temizlenmiş yağ yastığı içine transplante edilebilir. Bu nedenle, bu yordamı in vivo geliştirmek için meme epitel hücrelerinin kapasitesini değerlendirmek için yararlıdır .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
- Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).
- Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).
- Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
- Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439, 993-997 (2006).
- Medina, D. Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer. Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).
- Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal. Development. 129, 1377-1386 (2002).
- Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice. Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).
