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Biology

Brustepithelzellen Transplantation

doi: 10.3791/1849 Published: June 10, 2010

Summary

Dieser Artikel veranschaulicht das Verfahren, nach DeOme KB entwickelt

Abstract

Dieser Artikel beschreibt und vergleicht die Fettpolster Genehmigungsverfahren durch DeOme KB et al. 1 und die schonende Verfahren Brill B et al. 2, gefolgt von der Brustepithelzellen Transplantation. Die Mamma-Transplantation wird häufig von Mamma Biologen verwendet, weil es nutzt die Tatsache, dass bedeutende Entwicklung der Milch-Epithel nicht bis nach der Pubertät auftreten. Am Alter von 3 Wochen wird das Wachstum der Brustepithelzellen Baum bis in die Nähe der Brustwarze beschränkt und das Fettpolster ist weitgehend frei von Mamma-Epithel, sondern durch Alter von 7 Wochen der epithelialen duktalen Baum erstreckt sich über die gesamte Fettpolster. Deshalb, wenn diese kleiner Teil der Fettpolster mit Epithel, die Region zwischen die Brustwarze und den Lymphknoten, im Alter von 3 Wochen entfernt wird, wird die endogene Epithel nie bevölkern die Brustfettpolster und die Fettpolster als "cleared beschrieben ". Zu diesem Zeitpunkt kann Mamma Epithel aus einer anderen Quelle in den geräumten Fettpolster, wo es das Potenzial hat, Mamma-duktales Bäume durch die Fettpolster zu erweitern transplantiert werden. Dieses Verfahren wurde in vielen experimentellen Modellen einschließlich der Prüfung von Tumor-Phänotyp in transgenen Brustepithelzellen Gewebe ohne die verwirrende Wirkung des Genotyps auf das gesamte Tier 3 verwendet worden, bei der Identifizierung von Mamma-Stammzellen durch die Transplantation von Zellen in limitierter Verdünnung 4,5, Bestimmung wenn hyperplastische Knötchen an Mammatumoren vor 6 und um die Wirkung der vor Hormon-Exposition auf das Verhalten der Milch-Epithel 7,8 zu bewerten.

Drei Wochen alte Host-Mäuse sind betäubt, gereinigt und zurückhaltend auf einer chirurgischen Bühne. Ein mittsagittale Schnitt durch die Haut, aber nicht das Bauchfell, die sich vom Schambein bis zum Brustbein. Schrägschnitte werden durch die Haut aus der Mitte des sagittalen Schnitt über dem Becken in Richtung jedem Bein. Die Haut wird vom Peritoneum bis zum 4. inguinal Brustdrüse freizulegen. Die Fettpolster wird durch Entfernen der Fettpolster Gewebe anterior der Lymphknoten gelöscht. Epithel-Fragmente oder Epithelzellen sind in den verbleibenden gelöscht Fettpolster transplantiert und die Maus ist geschlossen.

Protocol

1. Vorbereitung der Transplantation Epithel

Frisches oder tiefgekühltes Spender Epithelgewebe lassen sich in den geräumten Fettpolster transplantiert werden, aber vor Zubereitung von Tiefkühl-Spender Epithel ist bequemer mit einem minimalen Rückgang der Transplantation Wirkungsgrad (> 85% Wirkungsgrad). Das Protokoll für die Zubereitung von Tiefkühl-Spender Epithel ist wie folgt:

Vor der Zubereitung Spenders zu transplantieren Epithel, bereiten einfrieren Medien für Epithel und aliquoten etwa 1ml in Kryoröhrchen. Dies kann bei 4 ° C gelagert werden für bis zu 6 Monate, bis sie benötigt. Freeze-Medium enthält DMEM/F12 Medien mit HEPES und NaHCO 3, 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) gepuffert.

Ernte Mamma Epithel aus einer kürzlich eingeschläfert weiblichen Maus.

  1. Waschen Sie die Maus mit 70% EtOH.
  2. Machen Sie eine Mid-sagittal geschnitten durch den Körper Wand, die sich vom Schambein bis zum Brustbein ohne Durchstechen der serösen Häute des ventralen Leibeshöhle. Machen Sie einen schrägen Schnitt aus dem ersten Schnitt am Schambein aufeinander Hinterbein (Abbildung 1).
  3. Peel die Wand des Körpers weg von der serösen Häute, die 5 th inguinal Brustdrüse an der Faszie an der Unterseite des Körpers Wand freizulegen. Der beste Weg, um dies zu erreichen wird durch Ergreifen der serösen Häute sorgfältig mit dem gekrümmten Teil eines Paares von einer gebogenen Pinzette, man aufpassen, nicht zu durchbohren der ventralen Leibeshöhle. Gleichzeitig greifen die Schnittkante der Haut mit geraden gezackten Zange und ziehen den Körper Wand weg von der serösen Häute.
  4. Identifizieren Sie die Lymphknoten in der Brustdrüse. Die Lymphknoten an der Kreuzung von drei prominenten Blutgefäße in der Brustdrüse und kann als eine dichte Knoten innerhalb der Fettpolster (Abbildung 2) zu spüren sein. Mit der Spitze ein Paar Augen Scheren, nip das Fettgewebe um den Knoten. Mit einem Zeigefinger auf der epidermalen Seite der Haut, Druck auf die Knoten aus dem Fettpolster erhöhen und eine Prise Sie ihn mit einem Paar von gebogenen Pinzette. Entsorgen Sie die Lymphknoten.
  5. Halten Sie die Ränder der Haut, fassen Sie das Brustfettpolster mit dem gekrümmten Rand aus einem Paar von gebogenen Pinzette und allmählich schälen Fettpolster vom Körper weg Wand. Folgen Sie die Richtung der Fettpolster auf der dorsalen Oberfläche der Maus, während Sie die gesamte Brustdrüse entfernt in einem Stück.
  6. Legen Sie die Brustdrüse auf einer sterilen Plastik Schneidblock. Fügen Sie eine kleine Menge von Medien, etwa 200 ul, an die Oberfläche der Drüse zu halten sie feucht. Mince der Drüse in 1mm Stück mit einer frischen Rasierklinge. Teilen Sie die zerkleinerten Drüse in vier Portionen und verteilen unter vier Kryoröhrchen von freeze Medien mit einer Pinzette. Legen Sie die Kryoröhrchen in einem Nalgene "Mr. Frosty Zelle Gefrierschrank, die 250 ml Isopropylalkohol wurde in der äußeren Kammer. Legen Sie die Nalgene Gefrierschrank in einem -70 ° C Gefrierschrank für 24 Stunden. Shop eingefroren Fläschchen Milch-Fragmente in flüssigem Stickstoff bis zur erforderlichen Transplantation. Jeder Kryoröhrchen enthält genug Brustdrüse Fragmente in den geräumten Fettpolster 4 bis 8 Host-Mäusen zu transplantieren.

2. Vorbereitung der Transplantation Cells

Unser Labor hat verschiedene Zelltypen, darunter verewigt Brustepithelzellen Zelllinien, Brusttumor-Zelllinien oder primären Mamma-Zellen in einer Maus gelöscht Fettpolster transplantiert. Das Protokoll für die Herstellung von Comma-D-Zellen für die Transplantation ist wie folgt:

  1. Comma-D-Zellen sind in regelmäßigen MECL Medien mit DMEM: F12 mit 2% Serum ausgewachsener Rinder (ABS), mEGF, Insulin, Antibiotika / Antimykotika (AB / AM) ergänzt.
  2. Ernte Comma-D-Zellen, wenn die Zellen 85% -90% konfluent sind.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 1200rpm für 5 Minuten die Zellen zu pelletieren. Resuspendieren der Zellen in frischem MECL Medien und passen Sie die Zelle eine Konzentration von 5 x 10 6 / ml.

Für die Transplantation von primären Mamma-Zellen, sind die primären Brustepithelzellen von Maus 5 th Milchdrüsen durch mechanische und enzymatische Dissoziation isoliert. Die Zellen werden in DMEM resuspendiert: F12 Medien und angepasst, um die gewünschte Konzentration, in der Regel 5 x 10 6 / ml.

3. Standard-Verfahren für das Clearing der Maus Brustfettpolster

  1. Anesthetize die drei Wochen alte Host-Maus. Wählen Mäuse, <12 g, um sicherzustellen, dass Mamma duktales Wachstum nicht eingeleitet worden sind. Wir verwenden 200mg/kg Körpergewicht von 2,2,2-Tribromethanol.
  2. Nach der Maus betäubt, fest begrenze die Maus, Bauchseite mit Gliedmaßen ausgestreckt, auf einer chirurgischen Stadium, so dass der Bauch ist verhöhnen. Vor der Operation, Administration Analgetika, entweder Bupivacain (<1mg/kg) oder Buprenorphin (0.05mg/kg), subkutan.
  3. Fassen Sie die Haut mit einer Pinzette ein paar Millimeter über dem Becken und heben Sie sie aus dem Bauch . Nip die Haut mit einer Schere und einem mittleren sagittalen Schnitt durch den Körper Wand, die sich vom Schambein bis zum Brustbein zu machen. Nicht gewaltsam öffnen die serösen Häute der ventralen Leibeshöhle. Machen Sie nicht Ihre erste Schnitt zu nahe an der Harnröhre in der Nähe, so dass Wundklammern wird nicht mit der Maus in der Lage zu urinieren stören.
  4. Von der ersten Schnitt machen schräge Schnitte durch die Haut ab Mitte der Linie quer über das Becken in Richtung jedes Hinterbein.
  5. Verwenden Sie den gekrümmten Bereich der gebogenen Pinzette vorsichtig greifen die serösen Häute. Verwenden Gewebe Zange, um den Schnitt-Marge der Haut fassen und ziehen den Körper Wand weg von der serösen Häute und setzen die 5 th inguinal Brustdrüse auf der Faszie an der Unterseite des Körpers Wand.
  6. Cauterize der Brustwarze, Knoten und zwei Arterien, die den Knoten (Abbildung 2)
  7. Trennen Sie die vierte und fünfte Drüsen. Cauterize den Rand des fünften Drüse Einwachsen aus dem 6. Drüse zu verhindern.
  8. Teilen Sie die Fettpolster des vierten Brustdrüse, indem über die Fettpolster mit einer Schere nur ventral (Seite in Richtung Brustwarze) des Knotens. Verwenden einer gebogenen Pinzette fest zu fassen ventralen Teil der Fettpolster an und ziehen Sie weg vom Körper Wand in einem Stück. Drücken Sie die ventralen Teil der Fettpolster zwischen zwei Folien und in ein Glas Histologie Färbung Schale mit Carnoy Fixativ. Dieses Gewebe wird fixiert und später mit Carmin Alaun-Lösung angefärbt, um gelöscht Margen (Abbildung 3) zu überprüfen. Reinigen Sie die Blende rund um die Region des entfernten Teil der Fettpolster, um alle Spuren der Brustdrüse mit einer gebogenen Pinzette entfernen.

4. Alternative "Sparing Vorgehensweise für Clearing the Fat Pad

Nach einem geworden ist mit dem Standard-Verfahren für das Clearing der Maus Brustfettpolster kompetent, können sie es vorziehen, die weniger invasive schonende Verfahren von Brill et al. (2008) 2 entwickelt Versuch.

  1. Bereiten Sie die Maus als für die Standard-Prozedur.
  2. Fassen Sie den Nippel des vierten inguinal Brustdrüse und schneiden Sie ein 3-5 mm Umfang Kreis rund um die Brustwarze mit der Spitze der Schere.
  3. Ziehen Sie die Brustwarze vom Körper weg, um den Schnitt Abschnitt der Haut lösen und ziehen die vierte inguinal Brustdrüse durch das Loch.
  4. Identifizieren Sie die Knoten. Verwenden Sie das Brenneisen, um den Knoten und die 6 th Brustdrüse durch das Loch cauterize.
  5. Cut und lösen Sie den oberflächlichsten Teil der 5 th Brustdrüse kurz vor dem Knoten. Die Brustwarze, kreisförmige Fläche von Haut und Teil des Brustfettpolster mit Epithel sind in einem Stück entfernt.

5. Tissue / Cell Transplantation

  1. Für die Transplantation Epithel-Fragmente, Abtauung ein Kryoröhrchen von Epithel und den Transfer der epithelialen Fragmente in eine Petrischale mit frischem Medium zu verwässern die DMSO. Machen Sie ein kleines Loch oder Tasche in den geräumten Fettpolster mit Schere Spitze für das neue Epithel. Setzen Sie einen 1mm Stück Spender Epithel in die Tasche mit Nadel Pinzette. Halten Sie die Tasche mit dem Gewebe Zange geschlossen, wie Sie die Nadel Zange zurückziehen, so das Gewebe bleibt bestehen.
  2. Für Transplantation von Zellen, injiziert 50.000 Zellen in 10 ul Medien in jedes Fettpolster mit einem 50 ul Hamilton-Spritze mit einem 22s-Gauge-Nadel.

6. Closing / Revival der Maus

  1. Ordnen Sie die Haut für die Schließung. Fassen gegnerischen Rande der Haut, halten sie zusammen mit einer Pinzette, heben sie sich von den serösen Häuten der ventralen Leibeshöhle und schließen mit Wundklammern. In der Regel ist es notwendig, zwei Klammern verwenden, um die Mitte des sagittalen Schnittführung und ein Clip für jeden Schrägschnitt für den Standard-Verfahren zu schließen. Vermeiden Sie behindern die Harnröhre. Es kann notwendig sein, um Lücken in der Haut nahe am Schnittpunkt der Mitte der sagittalen und schrägen Schnitten mit einer Naht. Der sparsame Verfahren benötigen nur eine Wunde Clip für jede Seite.
  2. . Platzieren Sie die Maus in ihrem Käfig und halten den Käfig unter eine Wärmelampe, bis die Maus wieder belebt hat.
  3. Die Wunde Clips sollte nach 2 Wochen entfernt werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Demonstration der Schnitt-Muster.

Abbildung 2
Abbildung 2. Lage der Lymphknoten, Blutgefäße, Nippel und endogenen Epithel. Cauterize an Orten angezeigt.

Abbildung 3
Abbildung 3. Whole mount zeigt, dass endogene Epithel auf den Bereich innerhalb des Kreises beschränkt und damit die Margen sind "klar".

7. Repräsentative Ergebnisse

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Abbildung 4. Whole mount von entfernt Fettpolster ab 3 Wochen alten Maus, welche gelöscht Margen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Whole mount von einem 10 Wochen alten Maus, welche Fettpolster des endogenen Mamma Epithel gelöscht.

Abbildung 6
Abbildung 6. Hämatoxylin und Eosin gefärbt Abschnitt eines gelöscht Fettpolster von einem 10 Wochen alten Maus.

Abbildung 7
Abbildung 7. Whole mount von einem 10 Wochen alten Maus zeigt normale Mamma duktalen Baum verpflanzt Epithel entwickelt.

Abbildung 8
Abbildung 8. Hämatoxylin und Eosin gefärbt Abschnitt Milchgänge von transplantierten Epithel entwickelt.

Abbildung 9
Abbildung 9. Hämatoxylin und Eosin gefärbt Abschnitt einer Brusttumor von transplantierten Epithel entwickelt.

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Discussion

In diesem Bericht stellen wir zwei alternative Methoden zum Löschen der Maus Brustfettpolster in Vorbereitung Brustepithelzellen Transplantationen. Die Standard-Verfahren wird seit seiner Entwicklung 1959 von DeOme et al. 1 Während mehr invasive, ist die Standard-Methode die bevorzugte Methode für das Training der Anfänger, weil die Struktur und Ausrichtung der Brustdrüse leicht betrachtet werden. Allerdings kann die schonende Verfahren durch den erfahrenen Chirurgen, weil mehrere Vorteile 2 bevorzugt werden. Vor allem der schonende Verfahren weniger invasiv ist, erfordert weniger Zeit und kann mit einer kurzen Inhalationsnarkose werden. Dies reduziert die Erholungszeit für die Maus. Der sparsame Verfahren kann auch bei jüngeren Mäusen (<21 Tage) Gewährleistung einer erfolgreichen Clearance von Epithel durchgeführt werden. Darüber hinaus gibt es eine Ermäßigung von Gewebeadhäsion nach der Operation, die vorteilhaft sein kann, wenn Experimente zu wiederholen Operation notwendig, um primäre Tumoren zu entfernen, noch erlauben anhaltenden langfristigen Beobachtung der Maus für die Metastasierung.

Das Transplantat Teil der Verfahren nutzt die Tatsache, dass die vollständige Entwicklung der Brustdrüse nicht bis nach der Pubertät auftreten. Vor Entfernung des kleinen Teil der Fettpolster, die die endogene Epithel "löscht" die restlichen Fettpolster der jungen Maus und beseitigt das Risiko für die Entwicklung von epithelialen duktalen Bäumen. Experimentelle Epithel kann in den geräumten Fettpolster des Host-Maus und Bewertung der daraus resultierenden Auswüchse transplantiert werden kann, ohne die verwirrende Wirkung der endogenen Host Epithel erfolgen. Daher ist dieses Verfahren nützlich für die Beurteilung der Leistung von Brustepithelzellen in vivo zu entwickeln.

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References

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Dunphy, K. A., Tao, L., Jerry, D. J. Mammary Epithelial Transplant Procedure. J. Vis. Exp. (40), e1849, doi:10.3791/1849 (2010).More

Dunphy, K. A., Tao, L., Jerry, D. J. Mammary Epithelial Transplant Procedure. J. Vis. Exp. (40), e1849, doi:10.3791/1849 (2010).

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