Bröst Epithelial transplantationen

Summary

Den här artikeln visar det förfarande som utvecklats av DeOme KB

Abstract

Den här artikeln beskriver och jämför fettet förfarande pad clearance utvecklades av DeOme KB et al. ¹ och sparsam förfarande som utvecklats av Brill B et al. ^2, följt av bröst epiteliala transplantationen. Det mammary transplantationen används flitigt av bröst biologer eftersom det tar fördel av det faktum att betydande utveckling av bröst epitel inte sker förrän efter puberteten. Vid 3 veckors ålder, är tillväxten av bröst epitelceller trädet begränsat till närheten av bröstvårtan och fettet pad är till stor del saknar bröst epitel, men med 7 veckors ålder epitelceller duktal trädet sträcker sig genom hela fet pad. Därför, om denna lilla del av fettet pad innehåller epitel är området mellan bröstvårtan och lymfkörtel, tas bort vid 3 veckors ålder, kommer den endogena epitelet befolkar aldrig juverfett pad och fettet pad beskrivs som "rensas ". Vid denna tid, kan bröst epitel från en annan källa ska transplanteras i rensas fett pad där den har potential att förlänga mammary duktal träd genom ut fettet pad. Detta förfarande har utnyttjats i många experimentella modeller inklusive granskning av tumör fenotyp i transgena bröst epitelvävnad utan störande inverkan av genotyp på hela djuret ^3, identifiering av bröst stamceller genom att transplantera celler i begränsad utspädning ^4,5, bestämma Om hyperplastiska knutor vidare till juvertumörer ^6, och för att utvärdera effekten av tidigare hormonexponering på beteendet hos de mammary epitel ^7,8.

Tre veckor gamla värd möss är bedövad, rengöras och återhållsam på en kirurgisk scen. En utvärdering efter halva sagittal snitt görs genom huden, men inte bukhinnan, sträcker sig från pubis till bröstbenet. Snedställda snitt görs genom huden från mitten av sagittal snitt över bäckenet mot varje ben. Huden dras bort från bukhinnan att exponera den 4: e ljumsk bröstkörtlarna. Fettet pad rensas genom att ta bort fettet främre pad vävnad till lymfkörtel. Epitel fragment eller epitelceller transplanteras in i rensas resterande fettet pad och musen är stängd.

Protocol

1. Beredning av Transplant Epitel

Färska eller frysta givare epitelvävnad kan transplanteras in i rensas fett pad, men före beredning av frysta givare epitel är mer praktiskt med en minimal minskning transplantation effektivitet (> 85% effektivitet). Protokollet för beredning av frysta givare epitel är följande:

Innan du förbereder epitel donator transplantation, förbereda frysa media för epitel och delprov om 1 ml till cryovials. Detta kan lagras vid 4 ° C i upp till 6 månader tills det behövs. Freeze medier innehåller DMEM/F12 media buffras med HEPES och NaHCO _3, 10% fetalt bovint serum (FBS) och 10% dimetylsulfoxid (DMSO).

Harvest bröst epitel från en nyligen avlivas kvinnlig mus.

1. Tvätta musen med 70% EtOH.
2. Gör en mid-sagittal skär genom kroppen väggen sträcker sig från pubis till bröstbenet utan piercing serösa membran av den ventrala kroppen hålighet. Gör en sned klipp från den första snitt vid pubis mot varje bakben (Figur 1).
3. Skala kroppen väggen bort från serösa membran att exponera ^{5: e} ljumsk mjölkkörtlarna bifogas fascian på undersidan av kroppen väggen. Det bästa sättet att uppnå detta är genom att greppa serösa membran försiktigt med den böjda delen av ett par böjda pincett, försiktigt så att inte punktera den ventrala kroppen hålighet. Samtidigt, ta tag i skär kanten av integument med raka räfflade pincett och dra kroppen väggen borta från serösa membran.
4. Identifiera lymfkörtel i bröstkörtlarna. Den lymfkörtel är beläget vid korsningen av tre framstående blodkärl i mjölkkörtlarna och kan kännas som en tät knöl i fettet pad (Figur 2). Med spetsen av ett par ögon saxar, kväva den fettvävnad som omger noden. Med pekfingret på den epidermala sidan av huden, utöva påtryckningar för att höja den nod ur fettet pad och nypa bort det med ett par böjda tång. Kasta lymfkörtel.
5. Håll marginalerna i huden, ta tag i juverfett kardborrebandet med böjda kanten av ett par böjda tång och gradvis skal fettet pad från kroppen väggen. Följ riktning av fettet pad mot dorsala ytan av musen när du tar bort hela bröstkörteln i ett stycke.
6. Sätt mjölkkörteln på en steril plast skär blocket. Tillsätt en liten mängd av media, ca 200 l, till ytan av körteln för att hålla den fuktig. Finhacka körteln i 1mm bitar med en fräsch rakblad. Dela det malda körteln i fyra delar och fördela på fyra cryovials av frysa media med pincett. Sätt cryovials i en Nalgene "Mr Frosty cell frys som har 250ml isopropylalkohol i det yttre facket. Sätt Nalgene frys i en -70 ° C frys i 24 timmar. Förvara fryst injektionsflaskor med mammary fragment i flytande kväve tills krävs för transplantation. Varje cryovial kommer att innehålla tillräckligt bröstkörtlarna fragment att transplantera in rensas fett kuddar av 4 till 8 värd möss.

2. Beredning av Transplant celler

Vårt lab har transplanterats olika celltyper, bland annat förevigat bröst epiteliala cellinjer, juvertumör cellinjer eller primär bröst celler till en mus rensas fet pad. Protokollet för beredning av Comma-D celler för transplantation är följande:

1. Komma-D celler odlas i vanliga MECL media som innehåller DMEM: F12 kompletteras med 2% serum från vuxet nötkreatur (ABS), mEGF, insulin, Antibiotika / Antimykotika (AB / AM).
2. Harvest Komma-D celler när cellerna är 85% -90% konfluenta.
3. Centrifugera cellsuspension vid 1200rpm i 5 minuter till pellets cellerna. Resuspendera cellerna i färska MECL medier och justera cellkoncentrationen till 5 x 10 ⁶ / ml.

För transplantation av primära bröst celler, är den primära bröst epitelceller isolerade från mus ^{5: e} bröstkörtlarna genom mekaniska och enzymatiska dissociation. Celler är suspenderade i DMEM: F12 media och justeras till önskad koncentration, vanligtvis 5 x 10 ⁶ / ml.

3. Standard föreskrifter för Clearing musen juverfett Pad

1. Bedöva tre veckor gammal värd mus. Välj möss som är <12 g för att säkerställa att mammary duktal tillväxten inte har inletts. Vi använder 200mg/kg kroppsvikt av 2,2,2-tribromoethanol.
2. När musen är sövda, fast hålla musen ventralsidan upp med benen utsträckta på en kirurgisk skede så att buken är hån. Före operation, administrera analgetika, antingen bupivakain (<1mg/kg) eller buprenorfin (0,05 mg) subkutant.
3. Ta tag i huden med pincett några millimeter ovanför bäckenet och lyft upp från buken . Kväva huden med sax och göra en mid-sagittal skär genom kroppen väggen sträcker sig från pubis till bröstbenet. Stick inte hål på serösa hinnor av den ventrala kroppen hålighet. Gör inte din första snittet för nära urinröret, så att såret klipp inte störa musen förmåga att urinera.
4. Från den första snittet, göra sneda skär genom huden från mittlinjen över bäckenet mot varje bakben.
5. Använd den böjda delen av böjda pincett för att försiktigt tag i den serösa membran. Använd vävnad pincett för att förstå skära marginalen i huden och dra kroppen väggen borta från seröst membran och exponera ^{5: e} ljumsk mjölkkörtlarna ligger på fascian på undersidan av kroppen väggen.
6. Bränna bröstvårtan, nod och två artärer som leder till noden (Figur 2)
7. Separera fjärde och femte körtlar. Bränna marginalen i den femte körteln för att förhindra inväxt från ^{6: e} körteln.
8. Dela fettet pad fjärde mjölkkörtlarna genom att skära tvärs över fettet pad med en sax bara ventrala (sidan mot bröstvårtan) för noden. Använd böjd pincett för att ordentligt förstå ventrala delen av fettet pad och dra den bort från kroppen väggen i ett stycke. Tryck på den ventrala delen av fettet pad mellan två bilder och sätta i ett glas histologi färgning maträtt som innehåller Carnoy är fixativ. Denna vävnad kommer att fastställas och färgas senare med karmin alun lösning för att kontrollera att clearade marginaler (Figur 3). Rengör fascian runt om i regionen för den borttagna delen av fettet pad att avlägsna alla spår av bröstkörteln med böjda pincett.

4. Alternativa "Sparing Förfarande för Rensa Fat Pad

Efter en har blivit behöriga med standardförfarandet för clearing musen juverfett pad, kan de föredrar att försöka sig på mindre invasiva sparing förfarande som utvecklats av Brill et al. (2008) ^2.

1. Förbered musen som för den vanliga proceduren.
2. Ta tag i bröstvårtan den fjärde inguinal mjölkkörtlarna och skär en 3-5 cirkel mm omkrets runt bröstvårtan med spetsen på saxen.
3. Dra nippel från kroppen att lossa den skurna delen av huden och drar den fjärde ljumsk mjölkkörtlarna ut genom hålet.
4. Identifiera noden. Använd diatermi för att bränna noden och den ^{6: e} mjölkkörtlarna genom hålet.
5. Klipp ut och ta bort de mest ytliga delen av ^{5: e} mjölkkörtlarna strax före noden. Bröstvårtan, cirkulär yta av hud och del av juverfett pad innehåller epitel avlägsnas i ett stycke.

5. Vävnad / cell Transplantation

1. För omplantering epitel fragment, avfrostning en cryovial av epitel och överföra epiteliala fragment till en petriskål med färska media för att späda ut DMSO. Gör ett litet hål eller ficka i det rensas fett pad med sax spetsen för den nya epitelet. Sätt en 1mm bit givare epitelet i fickan med nål pincett. Håll fickan stängs med vävnad pincett när du tar ut nålen pincetten så att vävnaden kvar.
2. För transplantera celler, injicera 50 tusen celler i 10 ìl av media i varje fett pad med en 50μl Hamilton spruta med en 22s nål.

6. Stängning / Revival av Mouse

1. Ordna huden för stängning. Fatta motsatta marginaler på huden, håll ihop dem med pincett, lyft bort dem från den serösa membran av den ventrala kroppens hålrum och nära med sår klipp. Oftast är det nödvändigt att använda två klipp för att stänga mitten sagittala snitt och ett klipp för varje sneda snitt för standardförfarande. Undvik att röra urinröret. Det kan bli nödvändigt att stänga luckor i huden i korsningen mitten av sagittal och sneda snitt med en sutur. Den skona förfarande kommer bara att kräva ett sår klipp för varje sida.
2. . Placera musen i hennes bur och hålla buren under en värme lampa tills musen har återupplivat.
3. Såret klipp bör tas bort efter 2 veckor.

Figur 1. Demonstration av snitt mönster.

Figur 2. Placering av lymfkörtlar, blodkärl, bröstvårtan och endogena epitel. Bränna på platser anges.

Figur 3. Hela berget visar att endogena epitelet är begränsad till området inom cirkeln och därmed marginalerna är "klara".

7. Representativa resultat

_r.jpg "alt =" Bild 4 "/>
Figur 4. Hela berg bort fett pad från 3 veckor gamla mus visar rensas marginaler.

Figur 5. Hela montera från en 10 veckor gamla mus som visar fett pad rensas av endogena bröst epitel.

Figur 6. Hematoxylin och eosin färgade avsnittet i en rensas fett pad från en 10 veckor gammal mus.

Figur 7. Hela montera från en 10 veckor gamla mus visar normala bröst duktal träd utvecklats från transplanterade epitel.

Figur 8. Hematoxylin och eosin färgade delen av bröst-kanaler utvecklats från transplanterade epitel.

Figur 9. Hematoxylin och eosin färgade avsnittet i en juvertumör utvecklats från transplanterade epitel.

Discussion

I denna rapport presenterar vi två alternativa metoder för att rensa musen juverfett pad som en förberedelse för bröst epitelceller transplantationer. Standarden Förfarandet har varit i bruk sedan dess utveckling 1959 av DeOme et al. ¹ Medan mer invasiva, är standard metoden att föredra för att utbilda nybörjare eftersom strukturen och orientering av bröstkörteln är lätt ses. Kan dock bespara förfarande föredras av de mer erfarna kirurgen på grund av flera fördelar ^2. Viktigast är sparsamt förfarandet mindre invasiva, kräver mindre tid och kan utföras med hjälp av en kort period av inhalationsanestesi. Detta minskar återhämtningsperioden för musen. Den skona proceduren kan också utföras på yngre möss (<21 dagar) se framgångsrika clearance av epitel. Dessutom finns det en minskning av vävnad vidhäftning efter operationen som kan vara en fördel om experiment kräver upprepad operation för att avlägsna primära tumörer, men medge fortsatt långsiktig observation av musen för metastaser.

Transplantationen del av proceduren tar fördel av det faktum att en fullständig utveckling av bröstkörtlarna inte sker förrän efter puberteten. Före avlägsnande av liten del av fettet pad som innehåller endogen epitel "rensar" resterande fettet pad av de unga musen och eliminerar risken för utveckling av epiteliala duktal träd. Experimentell epitel kan transplanteras in i rensas fett pad i den mottagande musen och bedömning av den därav utväxter kan göras utan en samverkan effekterna av endogena värd epitelet. Därför är detta förfarande användbar för att bedöma kapaciteten hos bröst epitelceller att utveckla in vivo.