Summary
このプロトコルは、マウスの卵管から卵母細胞や初期段階の受精卵を抽出する手法を示しています。 infindibulumを識別し、それに平滑末端の針を挿入する機能が正しく手順を実行するために不可欠です。
Abstract
日付に、唯一の研究はほとんどPeromyscus胚発生や生殖生物学の成功した操作を報告している。一緒にPeromyscus遺伝子ストックセンター（http://stkctr.biol.sc.edu）と、我々はこのシステムを開発するために必要な顕著な違いが予想されています。主な目標は、卵母細胞/初期胚の取得を最適化してきました。
Protocol
胚/卵検索
- 胚/卵母細胞の取得に先立って、KSOMが37℃CO 2インキュベーターとFHMに配置され、少なくとも2時間は-20℃から解凍する必要があります。 three凹面浅い井戸を含むガラス皿は、インキュベーターのKSOMの家降下するために使用されます。脱水を防ぐために、KSOMと皿は、底部に水を持っている蓋付き容器内に配置されています。この装置は、鉱物油を使用せずに蒸発を防ぎます。
- 排卵雌から卵管は、FHMのメディアに配置されます。向きとそのままinfindibulumを確保するために、卵巣の小さなセクションは子宮の卵管と小さなセクションと一緒にカットされます。鈍30ゲージの針をinfindibulumに鈍針を挿入して卵管から胚/卵母細胞を追放するために使用されます。卵管が通過するために針には小さすぎるので、infindibulumは胚を取り出すために使用されている必要があります。 infindibulumが破壊されるイベントでは、卵管は、オープンスライスまたは胚は押し出されている必要があります。
- 胚/卵母細胞はペトリ皿の底に沈んでいる脂肪滴の顕微鏡を集中さFHMのメディアに記載されています。これは高倍率より大きい表示領域を提供するので、胚/卵母細胞の分離は20倍で達成することができます。胚/卵母細胞はその周りに明確なリングを持っている丸い脂肪滴のようになります。キャピラリー引っ張らガラスを使用して、口の中のピペッティングは、、インキュベーションおよびさらなる操作のためのKSOMに胚/卵母細胞を移動するために使用されます。
卵母細胞の回収のための手順
準備
- FHMを解凍し、kSOMを準備。
- 数時間前の、底の水とチップボックス、CO 2インキュベーター内の場所での採卵容器と場所の場所のkSOM。
- ラボにケージを持参し、収穫の女性を殺す。
- あなたが卵管の一部を切断しないように卵巣の一部と子宮の一部をカットするように注意して卵管を切り取る。
- 小さなペトリ皿にFHMのメディアの場所。
- フラッシングに使用されるより多くのカップルFHMメディアシャーレを注ぐ。
フラッシング
- スパイラルの最後で1ミリリットルの針に接続されているフラッシュを針（30ゲージ鈍）を使用してください。
- 一度に卵を取り、針を用いて、卵巣の一部付近にある漏斗への挿入が接続されているまま。漏斗が破壊され、使用できない場合は、2つの鉗子を取ると卵管の一端を保持する。他のforcepで、優しくどんな胚のを取り出すために、歯磨き粉のチューブのように、絞る。
注：組織の多くは、それが付属しますので、これは、ペトリ皿の混乱を大量に作成しますので、その後別のペトリ皿を使用することがあります。
- 胚を表示するには、脂肪部分に顕微鏡を集中し、その周りに透明な丸と丸"脂肪部分"を探します。
注：胚は、脂肪と同じ外観を持っているので、見つけるのは難しいかもしれません。胚が底に沈むので、そちらを参照してください。
- 受信者の女性の膣スメアを実行してください。この段階で、彼らが偽でなければなりません。
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Discussion
この記事では、排卵誘発（過排卵）Peromyscusから卵母細胞の取得を示しています。排卵の使用は、（のような自然の発情周期とは対照的に）ため、はるかに大きい結果の数値に共通です。しかし、注意が排卵して培養を誘導するために使用されるホルモンの両方が影響を与えることがあるとして、そのような卵母細胞/胚を利用した結果の解釈には注意が必要です。
発情が確認されたとき、女性はeuthenizedと卵管は卵巣のごく一部と一緒に回収されます。卵巣の小さな領域がinfindibulumの場所のためのマーカーとして使用されます。 infindibulumは、組織の薄い層を介して投影し、しばしば回、卵巣の隣に座っている。この組織の他の側では、卵管の残りの部分は、コイル状であり、最終的には膣に導く。卵母細胞を抽出するinfindibulumを通して流体をプッシュするのが最善です。この方向は、原因で膣卵管のインターフェースにある一方通行のバルブに必要です。それらはバルブを逆方向に投影している場合は卵母細胞は損害を被ることがあります。
30 gaugle平滑末端の針はinfindibulumに挿入されます。平滑末端の針はinfindibulum開口部に適合しますが、卵管チューブに適合しません。したがって、infindibulumが解剖や卵母細胞の回収時に破損していないように注意する必要があります。 infindibulumが損傷している場合は、卵管を終了するにはいずれかのトラップ卵母細胞を許可するように鉗子を経由して圧迫することができます。
女性と仮定すると発情していた、生殖器官は、増加した血液供給のために赤い外観があり、腫れが表示されます。私たちは、試験された2つの鹿のマウスの種の違いを観察：P. polionotusは、卵母細胞の回収をより困難に、P. maniculatusよりもはるかにfattier卵巣と卵管を持っていた。
卵母細胞が卵管から削除したら、それらは低倍率で光学顕微鏡により観察されることがあります。低倍率での卵母細胞を表示すると、ユーザーはすぐにペトリ皿をスキャンすることができます。顕微鏡は、脂肪顆粒の最下層に集中するべきである。卵母細胞は、外周りのクリアリングで完全に丸い脂肪顆粒のようになります。卵母細胞の検出を支援するために、ペトリ皿を介して投影光を調整してみてください。ペトリ皿を軽く振っている場合に加えて、卵母細胞は脂肪滴に比べて移動することはありません。これらのヒントは、卵母細胞を見つけるために初心者の研究者を助けるかもしれないが、それは1つがプロシージャを使用して快適になる前にいくつかの臨床試験が必要になる可能性があります。
分離された卵母細胞は、幹細胞株、キメラの生産、または遺伝子操作の生産を含む、実験のさまざまな用途に使用されることがあります。我々はパラメータおよび排卵を誘導するために必要なタイミングでかなりの変化を発見しているが、検索のための一般的な手法は、多くのげっ歯類（鹿のマウスは実験用マウスおよびラットの両方から分岐〜30万年である）にも適用できるものです。我々はこのような技術が十分に確立されていない新しいシステムで働く人の利益になることが特に期待しています。
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Acknowledgments
私は彼の助け、忍耐および知識のためにPeromyscus遺伝子ストックセンターからマイクデューイに感謝いたします。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flushing needle | Tool | Zephyrtronics | ZT5-130-L | 30 G blunt |
| Forceps (2) | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Peromyscus | Animal | Peromyscus Genetic Stock Center | ||
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| FHM HEPES Buffered Media | Reagent | Specialty Media | MR-025-d | |
| KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL) | Reagent | Specialty Media | MR-020P-5F | |
| Mouth Pipette | Tool | Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing | ||
| Oocyte holding dish | Tool | Glass container with concave divets |
