Выделение и Обогащение Крыса мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и разъединении одной колонии Производные МСК
Summary
Крыса МСК были изолированы от бедра и большеберцовые кости, а затем обогащенный магнитной сортировки клеток. Сортировать клетки были подтверждены для экспрессии поверхностных маркеров с помощью проточной цитометрии. Эти клетки также культивировали при клональной плотности для формирования отдельных колоний, а затем эти колонии были разделены клонирования цилиндров.
Abstract
МСК являются население взрослых стволовых клеток, что является перспективным источником для терапевтического применения. Эти клетки могут быть выделены из костного мозга и может быть легко отделена от гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в связи с их пластиковых приверженности. Этот протокол описывает, как изолировать МСК крысы бедра и большеберцовые кости. Изолированных клеток были дополнительно обогащенные против двух МСК поверхностные маркеры CD54 и CD90 магнитными сортировки клеток. Выражение поверхностные маркеры CD54 и CD90 были подтверждены с помощью проточной цитометрии анализа. HSC маркер CD45 также был включен, чтобы проверить, отсортированных МСК были истощены ГСК. МСК естественно очень неоднороден. Есть субпопуляций клеток, которые имеют различные формы, пролиферацию и дифференциацию способностей. Эти субпопуляции все выражают известные маркеры МСК и не уникальный маркер до сих пор не определены для различных подгрупп населения. Таким образом, альтернативный подход выделить различные субпопуляции используется клонирование цилиндров выделить одного колонии клеток, полученных из. Клетки, полученные из одной колонии может быть культурным и оцениваться отдельно.
Protocol
Discussion
Этот протокол описывает, как изолировать и обогатить МСК. Метод для разделения одной колонии клеток, полученных также включена. Есть несколько шагов, которые важны для успешного разделения изоляции, обогащения и колонии. Делая изолятор от крыс, рекомендуется для фильтрации через сито ?…
Acknowledgements
Работа выполнена при частичной поддержке Национального института здравоохранения (R01GM079688, R21RR024439 и R21GM075838), Национальный научный фонд (конбет 0941055) и МГУ Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | ||
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | ||
| Cell strainer | BD Bioscience | 352350 | ||
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | ||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| BD Imagnet | BD Bioscience | 552311 | ||
| Biotin mouse IgG2a | BD Bioscience | 555572 | ||
| Biotin mouse IgG1 | BD Bioscience | 555747 | ||
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | ||
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | ||
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | ||
| BD Imag buffer | BD Bioscience | 552362 | ||
| Round-bottom tube | BD Bioscience | 352063 | ||
| Streptavidin particles | BD Bioscience | 557812 | ||
| SA-PE | R&D systems | F0040 | ||
| Cloning cylinder | Sigma | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
