Summary
Крыса МСК были изолированы от бедра и большеберцовые кости, а затем обогащенный магнитной сортировки клеток. Сортировать клетки были подтверждены для экспрессии поверхностных маркеров с помощью проточной цитометрии. Эти клетки также культивировали при клональной плотности для формирования отдельных колоний, а затем эти колонии были разделены клонирования цилиндров.
Abstract
МСК являются население взрослых стволовых клеток, что является перспективным источником для терапевтического применения. Эти клетки могут быть выделены из костного мозга и может быть легко отделена от гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в связи с их пластиковых приверженности. Этот протокол описывает, как изолировать МСК крысы бедра и большеберцовые кости. Изолированных клеток были дополнительно обогащенные против двух МСК поверхностные маркеры CD54 и CD90 магнитными сортировки клеток. Выражение поверхностные маркеры CD54 и CD90 были подтверждены с помощью проточной цитометрии анализа. HSC маркер CD45 также был включен, чтобы проверить, отсортированных МСК были истощены ГСК. МСК естественно очень неоднороден. Есть субпопуляций клеток, которые имеют различные формы, пролиферацию и дифференциацию способностей. Эти субпопуляции все выражают известные маркеры МСК и не уникальный маркер до сих пор не определены для различных подгрупп населения. Таким образом, альтернативный подход выделить различные субпопуляции используется клонирование цилиндров выделить одного колонии клеток, полученных из. Клетки, полученные из одной колонии может быть культурным и оцениваться отдельно.
Protocol
1. Выделение Крыса МСК
Мезенхимальные стволовые клетки были выделены из 6-8 недельных Sprague-Dawley крыс женского пола, как описано выше 1, 2. Изолированные МСК может присоединиться к пластиковой поверхности и легко расширить при в культуре пробирке.
- Животных был введен в камере наркоза и анестезии в течение приблизительно пяти минут. Во время анестезии, наблюдать за скоростью мигает, дыхания и двигательной активности. Удаление животного из камеры сразу же после его остановки двигательной активности и скорости стал мигать редко.
- Положите животное вниз по эксплуатации станций и убить животное шейки дислокации. Отрежьте большеберцовые кости бедра и с задней конечности, удалить кожу и мышцы.
- Положите расчлененный большеберцовые кости бедра и в 70% изопропанола в течение нескольких секунд и передачи 1X D-PBS.
- В кабинете биобезопасности, бедра и большеберцовые кости были переданы 10 см блюдо с DMEM. Каждая кость была затем проведена с помощью пинцета и два конца были разрезать ножницами с. Прикрепить 22G иглу шприца 3 мл и залейте его DMEM, затем промойте мозга в 50 мл трубку, вставив иглу одним открытым концом кости. Повторите 2 ~ 3 раза для каждой кости. Когда все кабачки были получены, ресуспендирования клеток и проходят клеточной суспензии через сито 70μm ячейки для удаления мусора костей и крови агрегатов.
- Спином вниз клеток на 200, 4 ° С в течение 5 минут и удалите супернатант аспирацией. Ресуспендируют клеток в среду 25 мл MSC (DMEM, содержащей 10% FBS и 1% Пен-Strep). 10 мл клеточной суспензии была посеяна в каждое блюдо культуры 10 см в общей сложности два блюда. Держите культуры блюд в 37 ° С и 5% СО 2 инкубатора для 1 ~ 2 недели. Средний меняли каждые 2 ~ 3 дня.
2. Обогащение Крыса МСК
Число поверхностных белков были использованы для обогащения МСК, в том числе CD54, CD90, CD73, CD105 и CD271 3-5. В нашем исследовании мы использовали CD54 и CD90 в качестве маркеров для обогащения МСК магнитными сортировки клеток.
- Когда клетки достигли около 80% слияния, аспирация средних и добавить 4 ~ 5 мл трипсина-EDTA к каждому блюду. Положите блюд обратно в инкубатор и выдержать в течение около 5 минут, чтобы клетка отряда. Как только клетки отделяли, добавьте равное количество питательной среды для инактивации трипсина. Сбор клеточной суспензии в 15 мл трубки и спина клетки вниз на 200, 4 ° С в течение 5 минут.
- Следующие шаги описывают, как обогатить МСК двумя поверхностные маркеры CD54 и CD90 в соответствии с инструкцией для сотовых разделения использованием BD IMagnet. Сотовые осадок ресуспендировали в ячейке окрашивания буфера (3% тепла инактивированная ФБС в 1X D-PBS) в 20 млн. клеток / мл. Биотинилированные CD54 антител (0.25μg на миллион клеток) и биотинилированного CD90 антител (0.15μg на миллион клеток) и перемешивают осторожно клеточной суспензии. После инкубации на льду в течение 15 минут, меченые клетки промывали избыточного объема буфера 1X BD IMAG. Меченых клеток были выделены вниз на 200, 4 ° С в течение 5 минут.
- Vortex BD IMAG стрептавидин частиц тщательно, добавить 40μl частиц на каждые 10 миллионов клеток. Смешайте частицы с меченых клеток тщательно и инкубировать клетки на 6 ~ 12 ° С в течение 30 минут. Это позволяет стрептавидин частиц связываться с биотинилированного анти-CD54 и анти-CD90, который связан с поверхностных белков CD54 и CD90 соответственно.
- Во время инкубационного периода, этикетки с круглым дном пробирки для сбора положительных фракции. После инкубации, довести объем маркировки до 20 млн клеток / мл с 1X буфере BD IMAG и передачи меченых клеток к положительному фракции коллекции трубки. Место положительно фракция трубки на BD IMagnet и так ее и оставим в течение 6 минут, затем удалите супернатант со стеклянной пипетки Пастера с трубкой положительно долю еще на IMagnet BD.
- Удалить положительно фракция трубку от IMagnet BD и поместите его на лед. Добавить 1 мл ледяной 1X BD IMAG буфера и ресуспендирования клеток нежной смешивания. Место трубку обратно на BD IMagnet и пусть это останется на 2 ~ 4 минуты. Удалить супернатант с новой стеклянной пипетки Пастера. Повторите промывание как описано в 2.5 еще раз.
- Снимите трубку от BD IMagnet и ресуспендирования клеток в культуральной среде, семена один 75см 2 колбы для поддержания клеток и 10 см блюдо для проточной цитометрии.
3. Проверка поверхностной экспрессии маркеров с помощью проточной цитометрии
Анализ проточной цитометрии было проведено с целью проверки клетки мы получили выразить CD54 и CD90. HSC маркер CD45 была использована для подтверждения того, что МСК были истощены ГСК.
- Когда клетки становятся ~ 80% сливающиеся, trypsinize клетки с помощью трипсина-EDTA и сбора клеток в 15 мл трубки. Центрифуга на 200 г, 4 ° С в течение 5 минут на сбор клеток.
- Аспирируйте супернатант и былч клетки с 1X D-PBS один раз. Ресуспендируют клетки в ячейке буфера окрашивания (1X D-PBS, содержащий 2% ЭТС и 0,05% азида натрия) до конечной концентрации 5 ~ 10 млн. кл / мл и сохранить клетки на льду. Алиготе 100 мкл клеточной суспензии на шесть помечены труб (1 клетки только; 2. Изотип IgG2a контроль;.. 3 Изотип контроль IgG1, 4 CD45; 5. CD54;.. 6 CD90).
- Добавить изотипа контроля и первичных антител в соответствующих концентрациях (IgG2a и IgG1: 20 мкл на миллион клеток CD45: 0.5μg на миллион клеток CD54: 0.25μg на миллион клеток CD90: 0.15μg на миллион клеток) и инкубируют при 4 ° С 30 минут.
- Вымойте клеток с 1X D-PBS в два раза, а затем ресуспендирования клеток в 100 мкл буфера окрашивания клеток. Добавить SA-PE (стрептавидин-фикоэритрин, используйте 0.15μg на миллион клеток) и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 минут в темноте.
- Вымойте меченых клеток с 1X D-PBS в два раза. Ресуспендируют клеток в 400μl буфера окрашивания клеток и трансфер в трубке сокола для анализа потока цитометрии.
4. Разделение одной колонии Производные МСК
МСК является гетерогенной популяции состоят из различных подгрупп населения с различной формы клеток, темпы роста, а также дифференциации способности 6. Однако все субпопуляции выразить известными маркерами MSC и поэтому не представляется возможным использовать маркеры, чтобы выделить эти субпопуляции. Таким образом, мы применили клонирования цилиндров выделить различные подгруппы населения, которые являются колониями образована одной клетки.
- Пластина клетки примерно в 50 ~ 100 клеток на 10 см блюдо. Инкубируйте в 37 ° С и 5% СО 2 инкубатора для 1 ~ 2 недели. В течение этого периода, изучить хорошо изолированных колоний с инвертированным микроскопом. После колонии достигли достаточно большой размер (лучше больше, чем 100 клеток в каждой колонии), знак колонии с шулер в нижней части блюда. Если взять колонию быть отмечены, убедитесь, что Есть не окружающие колонии около выбрал один.
- Аспирируйте средних и мыть блюда сразу с 1X D-PBS. Возьмите стерильный цилиндр клонирования стерильным пинцетом и аккуратно поместить его вокруг отмечен колонии. Повторите это, пока все отмеченные колониях клонирования цилиндра размещены более. Взял колонии должны быть далеко друг от друга, что каждый цилиндр клонирования содержит только одну колонию.
- Добавить 100 мкл трипсина-EDTA каждому клонирования цилиндр и поставить блюдо обратно в инкубаторе в течение ~ 5 минут. Через 5 минут, проверьте клетки под микроскопом, чтобы увидеть, являются ли они округления. Когда клетки поднял, добавьте равное количество питательной среды для инактивации трипсина. Смешайте клеточной суспензии с 200 мкл micropipettor и передачи клеточной суспензии для 60мм блюдо с 3 мл нагретого питательной среды. Этикетка блюда должным образом, и поместите их в инкубатор. Отслеживание морфологических изменений в течение ближайших нескольких дней.
5. Представитель Результаты
Согласно протоколу, описанному в части выделения МСК крысы, пластик приверженцем МСК должны быть видны на следующий день после покрытия. Как клетки продолжают размножаться, сливающийся клетки должна выглядеть клетки показано на рисунке 1а. Когда клетки достигают ~ 80% слияния (рис. 1Б), субкультивирования может быть осуществлена. Во время субкультура, трипсина-EDTA был использован для отсоединения клеток и поднял клетки малого и круглые, как показано на рисунке 1С.
Рисунок 1. Фазовый контраст изображения МСК крысы. (А) Сливной МСК. Большинство клеток шпинделя нравится или звездных. (B) МСК около 80% слияния. (C) Отменены клеток после трипсинизации маленькие и круглые.
После МСК обогащаются магнитной сортировки клетки, анализа проточной цитометрии осуществляется для проверки выражений поверхности маркер. Если обогащение хорошо, клетки должны показать положительное окрашивание на маркеры CD54 MSC и CD90, но отрицательный против HSC маркер CD45 (рис. 2). Изотип управления IgG2a и IgG1 используются в качестве отрицательного контроля.
Рисунок 2. Проточная цитометрия Анализ МСК для поверхностных маркеров. МСК были помечены с антителами против IgG2a (изотипа контроль 1), IgG1 (изотипа контроль 2), CD45, CD54 и CD90. МСК выразил CD54 и CD90, но не CD45.
Когда клетки высевают на надлежащее клональной плотности, колонии должны подняться из отдельных клеток. Рис 3A представляет колония образованных одной ячейки. Клонирование цилиндры могут быть использованы для отдельных колоний и клетки, полученные из колонии можно выращивать отдельно. Рис 3В и 3С представляет клетки, полученные из двух отдельных колоний. Клетки, полученные из колонии 1, шпиндель, как (рис. 3б), тогда как клетки, полученные из колонии 2 круглые (рис. 3С).
Рисунок 3. Колония Формирование МСК и одной колонии клеток, полученных из. МСК культивировали при клональной колонии форме плотности человека. Эти колонии могут быть разделены путем клонирования цилиндров и клеток из разных колоний может быть культурным отдельно. (А) представитель колонии образована МСК при посеве на клональной плотности. (B) шпинделя, как клетки, полученные из одной колонии. (C) Круглые клетки, полученные из другой колонии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает, как изолировать и обогатить МСК. Метод для разделения одной колонии клеток, полученных также включена. Есть несколько шагов, которые важны для успешного разделения изоляции, обогащения и колонии. Делая изолятор от крыс, рекомендуется для фильтрации через сито ячейки или стерильной нейлоновая сетка такого же размера, чтобы избавиться от сгустков крови и костного мусора. После покрытия клетки на ночь, много мертвых клеток будет плавающим в средне-и отмершие клетки удаляются заменой свежей средой, которые должны помочь росту прилагается клеток.
Магнитной сортировки клеток в этом протоколе описываются способы выполнения положительного отбора, и подобные процедуры могут быть использованы для выполнения отрицательного отбора. Количество антител, которые будут добавлены могут отличаться и оптимизации, необходимой для достижения лучшего сортировки. Это также верно для маркировки клеток для анализа потока цитометрии. Если не работает анализа проточной цитометрии для помечены образцы немедленно, образцы могут быть исправлены с помощью 2% формальдегида и запустить позже. Тем не менее, длительное хранение не рекомендуется, поскольку это имеет тенденцию к увеличению авто-флуоресценции и качества жертву образца.
Ключевую роль для колонии разделение посева на право плотность клеток (которые должны быть оптимизированы экспериментально) и расположения одного клона, которые не окружены другими клонами. Если Есть другие клоны рядом, клонирование цилиндров может включать в себя около клонов и клеток, полученных больше не будет от одного клона. При размещении клонирования цилиндра над клоном, также будьте осторожны и не двигайте это над поверхностью посуды так как это вызовет силиконовой смазки в нижней части цилиндра клонирования для покрытия клеток и предотвратить попадание трипсина клетки отделить их.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Работа выполнена при частичной поддержке Национального института здравоохранения (R01GM079688, R21RR024439 и R21GM075838), Национальный научный фонд (конбет 0941055) и МГУ Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag buffer | BD Biosciences | 552362 | |
| Round-bottom tube | BD Biosciences | 352063 | |
| Streptavidin particles | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
