Summary
וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה - התכונות העיקריות של אנגיוגנזה - מוצגים.
Abstract
אנגיוגנזה היא תהליך מורכב רב שלבי, שבו, בתגובה לגירויים angiogenic, כלי חדש נוצרות vasculature הקיים. צעדים אלה כוללים: ירידה של התפשטות קרום, מרתף והגירה (נביטה) של בתאי האנדותל (EC) לתוך המטריצה תאיים, יישור של EC לתוך מיתרי, מסתעפת, היווצרות לומן, השקה, ועל היווצרות קרום מרתף חדשה. רבים מבחני חוץ גופית פותחו כדי ללמוד את התהליך הזה, אבל רוב לחקות רק בשלבים מסוימים של אנגיוגנזה, ואת מורפולוגית כלי בתוך מבחני לעתים קרובות לא דומים כלי in vivo. בהתבסס על עבודה קודמת על ידי Nehls ו Drenckhahn, יש לנו אופטימיזציה ב assay אנגיוגנזה במבחנה אשר מנצל האדם וריד הטבור EC ו fibroblasts. זה המודל משחזר את כל השלבים המוקדמים המפתח של אנגיוגנזה, חשוב, כלי התצוגה לומן אינטר פטנט מוקף EC מקוטב. EC הם מצופים על microcarriers cytodex ומוטבעים לתוך ג'ל הפיברין. Fibroblasts הם שכבות על גבי ג'ל שבו הם מספקים גורמים מסיסים הכרחי לקדם EC הנבטה מפני השטח של החרוזים. אחרי כמה ימים, כלי רבים נוכחים כי ניתן בקלות לצפות תחת ניגוד פאזה זמן לשגות מיקרוסקופ. וידאו זה מדגים את השלבים העיקריים בהקמת אלה תרבויות.
Protocol
הכנות CELLS
- תביאו את HUVEC ו fibroblasts ב% M199/10 FBS / עט סטרפטוקוקוס (1:100) 1-2 ימים לפני ואגלי.
- החלף בינוני עד EGM-2 (Clonetics) יום לפני ואגלי עבור HUVEC ויום לפני הטבעה עבור fibroblasts.
- ריכוז של ~ 400 HUVEC לכל חרוז יש צורך.
- 20,000 fibroblasts היטב לכל צורך.
ציפוי החרוזים עם HUVEC - -1 יום
- Trypsinize HUVEC.
- אפשר להסתפק חרוזים (אינם צנטריפוגות!). לשאוב supernatant ולשטוף את החרוזים בקצרה 1 מ"ל של מדיום EGM-2 חמים.
- 2500 חרוזים Mix w / 1x10 6 HUVEC ב 1.5 מ"ל של מדיום EGM-2 חם צינור FACS. המקום אותו במאונך בחממה. (זה יהיה מספיק ~ 10 בארות. הסולם במידת הצורך)
- דגירה במשך 4 שעות ב 37 ° C, מטלטלת את הצינור כל 20 דקות. (ציפוי טוב הוא קריטי עבור נביטה).
- לאחר 4 שעות, להעביר את החרוזים מצופים על בקבוק T25 ב 5 מ"ל של EGM-2 ו לעזוב O / נ
הטבעה חרוזי מצופה הפיברין GEL - יום: 0
- הכן את הפתרון מ"ג / מ"ל 2.0 פיברינוגן (ראה סעיף מתכון).
- הוסף 0.15 יחידות / מ"ל של aprotinin לפתרון פיברינוגן.
- העברת חרוזים מצופים אל צינור חרוטי 15ml ולתת חרוזים להתיישב. חרוזים Resuspend ב 1mL של EGM-2 ו להעביר צינור צנטריפוגות 1.5mL.
- שטפו את החרוזים 3X עם 1mL של EGM-2 על ידי pipeting לאט מלמעלה למטה.
- ספירת חרוזים על coverslip ו resuspend בפתרון פיברינוגן בריכוז של ~ 500 חרוזים / mL.
- הוסף 0.625 יחידות / מ"ל של תרומבין היטב כל אחד.
- הוסף 0.5 מ"ל של פיברינוגן השעיה / חרוז היטב בכל צלחת 24 באר.
שנה את קצה פיפטה עבור כל טוב! - מערבבים את תרומבין ואת פיברינוגן על ידי עולה ויורדת בעדינות עם קצה פיפטה ~ 4 עד 5 פעמים. תיזהר לא לעשות בועות גדולות.
- השאירו את צלחת 5 דקות בשכונה, ואז למקם אותו על 37 ° C-חממה 10-15 דקות כדי ליצור קריש דם.
- בזמן ההמתנה הקריש, trypsinize fibroblasts.
- הוסף 1 מ"ל של EGM-2 לכל גם טיפה חכם.
- זרעים fibroblasts על גבי הפיברין ג'ל בריכוז של 20,000 תאים לכל טוב.
הערות:
בדרך כלל, כאשר קריש הפיברין נוצר, תראה בועות קטנטנות בתוך הג'ל. אל תדאג, הם ייעלמו בתוך 3-4 ימים.
שנה את התקשורת בכל יום אחר, כלומר, יום 2, 4, 6, וכו '..
ביום 3 או 4 אתה צריך להתחיל לראות נביטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קיימת הסכמה גוברת תלת ממדי (3D) ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה להציע מודל אשר הרבה יותר לסביבה מאשר בפועל in vivo יכולה להיות מושגת באמצעות תרבויות 2D. ניכר כי מערכות 3D מעולה צריך להיות לשחזור, ולהיות מסוגלים לחקות כמה שלבים עיקריים של אנגיוגנזה. בעוד מספר מבחני 3D הקודם פותחו, רבים מהם גם להשתמש שקשה להשיג תאים כלי הדם, או לשחזר רק חלק מהשלבים. בסרטון הזה, אנו מתארים ולבצע אופטימיזציה assay אנגיוגנזה במבחנה אשר מנצל האדם וריד הטבור EC, אשר להשגה בקלות ואת EC הנפוץ ביותר במחקר וסקולרית. Assay, במשך מספר ימים, באופן עקבי מתרבה עם כלי ארוך, לומן ברור אינטר פטנט מוקף EC מקוטב. בשלבים מאוחרים יותר של EC הסתעפות ואיחוי של כלי (השקה) הם נצפו גם. חשוב לציין, שבתרבויות אלה HUVEC עוברים את כל השינויים המורפולוגיים כי הם ראו את כלי הדם EC, גם in vivo או במבחנה, כולל הנבטה, הגירה היישור, היווצרות התרבות צינור, הסתעפות ו השקה. ביטוי גנים פרופיל של השינויים HUVEC, במקביל, כדי להתאים באופן הדוק יותר של כלי הדם EC. לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור במודל אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים חשובים בתהליך זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
