Summary
このビデオでは、血管新生の反復するいくつかの段階そのin vitroでの血管新生アッセイのプロトコルを示しています。タイムラプス発芽の画像、管腔形成、分岐と吻合 - 血管新生の主要な機能は - 示されています。
Abstract
血管新生は血管新生の刺激に応答して、新しい血管が既存の血管系から作成される、複雑なマルチステップのプロセスです。これらの手順は次のとおりです。基底膜の分解、細胞外マトリックスへの内皮細胞の増殖と移行（萌芽）（EC）、コードへのECのアラインメント、分岐、管腔形成、吻合、および新たな基底膜の形成を。 in vitroアッセイの多くは、このプロセスを研究するために開発が、ほとんど唯一の血管新生の特定の段階を模倣し、形態学的アッセイ内の血管が頻繁にin vivoで血管似ていないされています。 NehlsとDrenckhahnによる以前の仕事に基づいて、我々は、ヒト臍帯静脈ECと線維芽細胞を利用したin vitroでの血管新生アッセイに最適化されている。このモデルのすべての血管新生の主要な初期段階の反復するとは、重要なことは、血管が偏ECに囲まれた特許細胞間ルーメンを表示します。 ECはcytodexマイクロキャリア上に塗布し、フィブリンゲルに埋め込まれている。線維芽細胞は、それらがECはビーズの表面から発芽促進に必要な可溶性因子を提供するゲルの上に積層されている。数日後、数多くの血管が簡単に位相コントラストとタイムラプス顕微鏡で観察できる存在です。このビデオでは、これらの培養物をセットアップする重要なステップを示しています。
Protocol
はPREPARING CELLS
- FBS /ペン - 連鎖球菌（1:100）1〜2日ビーズの前にM199/10％でHUVECと線維芽細胞を持ち出す。
- EGM - 2（Clonetics社）繊維芽細胞のために埋め込む前にHUVECと一日のためにビーズの前日に培地を切り替えます。
- 〜400 HUVECあたりビーズの濃度が必要です。
- よく20,000線維芽細胞が必要です。
HUVECでビーズコーティング - DAY -1
- HUVECをトリプシン処理。
- ビーズが沈殿することができます（遠心分離機しないでください！）。上清を吸引除去し、暖かいEGM - 2培地1mLで簡単にビーズを洗浄する。
- FACSチューブに暖かいEGM - 2培地を1.5mLのミックス2500ビーズのw / 1 × 10 6 HUVEC。インキュベーター内に垂直に置きます。 （これは〜10ウェルのために十分になります。必要に応じてスケールアップ）
- 管ごとに20分を振って、37℃で4時間インキュベートする。 （グッドコーティングが発芽するために重要です。）
- 4時間後、EGM - 2の5mLのでT25フラスコにコーティングされたビーズを転送し、O / Nを残す
0日目 - フィブリンゲルコーティングされたビーズを埋め込み
- 2.0 mg / mLのフィブリノーゲン溶液を（レシピの項を参照）を準備。
- フィブリノーゲン溶液にアプロチニン0.15単位/ mLを追加。
- 15mlのコニカルチューブにコーティングされたビーズを移し、ビーズは沈殿ができます。 EGM - 2と1.5mlの遠心チューブに移す液1mLに再懸濁し、ビーズ。
- ゆっくりと上下にペッティングによってEGM - 2液1mLで3倍ビーズを洗浄する。
- カバースリップ上ビーズを数えて、〜500ビーズ/ mLの濃度でフィブリノーゲン溶液に再懸濁します。
- 各ウェルにトロンビンの0.625単位/ mLを追加。
- 24ウェルプレートの各ウェルにフィブリノーゲン/ビーズ懸濁液0.5 mLを加え。
各ウェルのピペットチップを変更する！ - ピペットの先端で軽く〜4〜5回上下に移動してからトロンビンとフィブリノゲンを混ぜる。大きな泡を作るように注意してください。
- フードで5分間プレートを残し、その後血栓を生成するために10〜15分間37℃のインキュベーターに入れてください。
- 血栓を待っている間に、線維芽細胞をトリプシン処理。
- EGM - 2あたりも滴を1 mLを追加。
- ウェルあたり20,000細胞の濃度でフィブリンゲルの上にシードの線維芽細胞。
注意：
通常、フィブリンゲルを形成する際には、ゲルに小さな泡が表示されます。心配しないで、彼らは3-4日で消えます。
すなわち、2日目、4、6、など、一日おきにメディアを変更する..
3〜4日までに、発芽を確認して開始する必要があります。
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Discussion
in vitroでの血管新生アッセイにおける3次元（3D）は2Dの文化を使って達成できるよりも生体内で実際の環境にかなり近いですモデルを提供する成長コンセンサスがある。それは、優れた3Dシステムは再現性、及び血管新生の主要なステップのいくつかを模倣することができるはず明らかである。いくつかの以前の3Dアッセイが開発されているが、これらの多くは、いずれかを使用して、ハードを取得するために微小血管細胞を、または唯一のステージのいくつかを再現。このビデオでは、我々は説明し、血管研究で容易に入手し、最もよく使用されるECであるヒト臍帯静脈ECを利用したin vitroでの血管新生アッセイに最適化を実行。アッセイは、数日間にわたって、一貫して偏光ECに囲まれて透明な、特許細胞間ルーメンで長い船を再現。後でEC分岐と血管の融合（吻合）の段階でも観察されています。重要なことは、これらの培養でHUVECは発芽、遊走、整列、増殖、管腔形成、分岐と吻合を含め、in vivoまたはin vitroでのどちらか、微小血管ECで見られる形態学的変化のすべてを受ける。 HUVEC変化の遺伝子発現プロファイルは、並行して、より密接に微小血管ECのそれと一致する。結論として、我々はin vitroでの血管新生モデルでの最適化されたプロトコルを提示する、このプロセスの反復するいくつかの重要な段階。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
