Summary
इस वीडियो इन विट्रो angiogenesis परख में एक के प्रोटोकॉल को दर्शाता है कि angiogenesis के कई चरणों का स्मरण दिलाता है. अंकुरण के समय चूक छवियों, लुमेन गठन, शाखाओं में बंटी और सम्मिलन - angiogenesis की प्रमुख विशेषताएं - दिखाए जाते हैं.
Abstract
Angiogenesis एक जटिल बहु कदम प्रक्रिया है, जहां angiogenic stimuli करने के लिए प्रतिक्रिया में, नए जहाजों मौजूदा vasculature से बनाया जाता है. इन चरणों में शामिल हैं: तहखाने झिल्ली प्रसार और प्रवास (अंकुरण) endothelial कोशिकाओं के बाह्य मैट्रिक्स, चुनाव आयोग के तार में संरेखण में (ईसी) की गिरावट, शाखाओं में बंटी, लुमेन गठन, सम्मिलन, और एक नया तहखाने झिल्ली के गठन. इन विट्रो assays में कई करने के लिए इस प्रक्रिया का अध्ययन किया गया विकसित किया है, लेकिन अधिकांश केवल angiogenesis के कुछ चरणों की नकल, और आकृति विज्ञान assays के भीतर वाहिकाओं अक्सर vivo में जहाजों समान नहीं है. Nehls और Drenckhahn द्वारा पिछले काम के आधार पर, हम इन विट्रो angiogenesis परख है कि मानव नाल की शिरा चुनाव आयोग और fibroblasts इस्तेमाल में एक अनुकूलित है. यह मॉडल स्मरण दिलाता है angiogenesis की महत्वपूर्ण प्रारंभिक दौर के सभी और, महत्वपूर्ण बात, बर्तन पेटेंट कहनेवाला polarized चुनाव आयोग से घिरे lumens प्रदर्शन. चुनाव आयोग cytodex microcarriers पर लेपित हैं और एक आतंच जेल में एम्बेडेड. Fibroblasts जेल, जहां वे आवश्यक घुलनशील कारकों है कि चुनाव आयोग मोतियों की सतह से अंकुरण को बढ़ावा देने प्रदान के शीर्ष पर स्तरित हैं. कई दिनों के बाद, कई जहाजों मौजूद है कि आसानी से चरण विपरीत और माइक्रोस्कोपी समय चूक के तहत मनाया किया जा सकता है. इस वीडियो इन संस्कृतियों की स्थापना में महत्वपूर्ण कदम दर्शाता है.
Protocol
तैयारी कोशिकाओं
- FBS / पेन Strep (1:100) 1-2 दिनों beading के पहले M199/10% HUVEC और fibroblasts लाओ.
- Fibroblasts के लिए एम्बेडिंग पहले HUVEC और दिन के लिए beading से पहले (Clonetics) दिन ईजीएम-2 मध्यम स्विच.
- ~ 400 HUVEC प्रति मनका के एक एकाग्रता की जरूरत है.
- अच्छी तरह से प्रति 20,000 fibroblasts की जरूरत है.
कोटिंग HUVEC के साथ मोती - दिवस -1
- HUVEC Trypsinize.
- के लिए व्यवस्थित (अपकेंद्रित्र नहीं!) मोती की अनुमति दें. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और मोती गर्म मध्यम ईजीएम - 2 के 1 एमएल में संक्षेप में धो.
- मिक्स 2500 w / 1x10 मोती एक FACS ट्यूब में गर्म मध्यम ईजीएम-2 के 1.5 एमएल में 6 HUVEC. इनक्यूबेटर में यह खड़ी प्लेस. (यह पर्याप्त के लिए ~ 10 कुओं. स्केल अगर जरूरत होगी)
- 37 ° C से कम 4 घंटे के लिए सेते हैं, ट्यूब हर 20 मिनट मिलाते हुए. (अच्छा कोटिंग अंकुरण के लिए महत्वपूर्ण है.)
- 4 घंटे के बाद, ईजीएम-2 के 5ml में एक फ्लास्क T25 लिपटे मोतियों के हस्तांतरण और ओ / एन छोड़
0 दिन - आतंच जेल में लेपित मोती embedding
- 2.0 मिलीग्राम / एमएल फाइब्रिनोजेन समाधान (नुस्खा अनुभाग देखें) तैयार करें.
- फाइब्रिनोजेन समाधान के लिए 0.15 इकाइयों / aprotinin का एमएल जोड़ें.
- एक 15ml शंक्वाकार ट्यूब लिपटे मोतियों के स्थानांतरण और मोती बसा. ईजीएम-2 के 1ml और एक 1.5mL अपकेंद्रित्र ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण में Resuspend मोती.
- ऊपर और नीचे धीरे धीरे pipeting 3X मोती ईजीएम-2 के 1ml के साथ धोएं.
- Coverslip पर मोतियों की गणना और ~ 500 मनकों / एमएल के एक एकाग्रता में फाइब्रिनोजेन समाधान में resuspend.
- 0.625 इकाइयों / एमएल थ्रोम्बिन के प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें.
- 24 अच्छी तरह से एक थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से फाइब्रिनोजेन / मनका निलंबन की 0.5 एमएल जोड़ें.
प्रत्येक के लिए अच्छी तरह विंदुक टिप बदलें! - और ऊपर जा रहा है और नीचे धीरे विंदुक टिप के साथ ~ 4 से 5 बार द्वारा फाइब्रिनोजेन थ्रोम्बिन मिक्स. बड़े बुलबुले नहीं कर सावधान रहना.
- हुड में 5 मिनट के लिए थाली छोड़ दें, तो यह 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10-15 मिनट के लिए जगह के लिए एक थक्का उत्पन्न.
- जबकि थक्का के लिए इंतज़ार कर रहे, fibroblasts trypsinize.
- ईजीएम-2 के 1 एमएल प्रति अच्छी तरह बुद्धिमान बूंद जोड़ें.
- आतंच जेल की अच्छी तरह से प्रति 20,000 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में शीर्ष पर बीज fibroblasts.
टिप्पणियाँ:
आमतौर पर, जब आतंच जेल बनाई है, आप जेल में छोटे बुलबुले देखेंगे. चिंता मत करो, वे 3-4 दिनों में गायब हो जाएगा.
मीडिया हर दूसरे दिन बदलें, यानी, 2 दिन, 4, 6, आदि ..
दिन 3 या 4 तक आप अंकुरण देख शुरू कर देना चाहिए.
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Discussion
वहाँ एक से बढ़ आम सहमति है कि इन विट्रो angiogenesis assays में तीन आयामी (3 डी) एक मॉडल है जो बहुत vivo में वास्तविक पर्यावरण के लिए करीब से 2D संस्कृतियों का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है है की पेशकश है. यह स्पष्ट है कि बेहतर 3D प्रणालियों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो, और चाहिए angiogenesis के प्रमुख कदम के कई नकल करने में सक्षम हो. जबकि पिछले कई 3D assays विकसित किया गया है, इनमें से कई या तो कड़ी मेहनत से प्राप्त microvascular कोशिकाओं का उपयोग, या केवल कुछ चरणों की पुनरावृत्ति. इस वीडियो में, हम का वर्णन है और इन विट्रो angiogenesis परख है कि मानव नाल की शिरा चुनाव आयोग का इस्तेमाल करता है, जो आसानी से प्राप्य है और संवहनी अनुसंधान के क्षेत्र में सबसे अधिक इस्तेमाल किया चुनाव आयोग में अनुकूलित प्रदर्शन. परख, कई दिनों के पाठ्यक्रम पर, लगातार स्पष्ट है, पेटेंट कहनेवाला polarized चुनाव आयोग से घिरे lumens के साथ लंबे समय वाहिकाओं reproduces. चुनाव आयोग शाखाओं में बंटी और संलयन वाहिकाओं (सम्मिलन) के बाद के चरणों में भी मनाया जाता है. महत्वपूर्ण बात, इन संस्कृतियों में HUVEC morphological परिवर्तन है कि microvascular चुनाव आयोग के साथ देखा जाता है सभी से गुजरना है, या तो के vivo में या इन विट्रो में अंकुरण, प्रवास, संरेखण, प्रसार, ट्यूब गठन, शाखाओं में बंटी और सम्मिलन. समानांतर में HUVEC परिवर्तन करने के लिए, जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल और अधिक बारीकी से microvascular चुनाव आयोग की कि मैच. अंत में, हम इन विट्रो angiogenesis मॉडल में एक के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल मौजूद है कि स्मरण दिलाता है इस प्रक्रिया के कई महत्वपूर्ण चरणों.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
