Summary
Deze video toont het protocol van een in vitro angiogenese test die recapituleert verschillende stadia van angiogenese. Time-lapse beelden van kiemen, lumen vorming, vertakking en anastomose - belangrijkste kenmerken van angiogenese - worden weergegeven.
Abstract
Angiogenese is een complexe multi-step proces, waarbij, in antwoord op angiogene stimuli, nieuwe schepen worden gemaakt van de bestaande bloedvaten. Deze stappen zijn: afbraak van de basale membraan, proliferatie en migratie (ontspruiten) van endotheelcellen (EC) in de extracellulaire matrix, de uitlijning van de EC in de koorden, vertakking, lumen vorming, anastomose, en de vorming van een nieuwe kelder membraan. Velen in vitro testen zijn ontwikkeld om dit proces te bestuderen, maar de meeste alleen maar na te bootsen bepaalde stadia van de angiogenese, en morfologisch de schepen binnen de tests vaak niet lijken op schepen in vivo. Op basis van eerder werk van Nehls en Drenckhahn, hebben we een geoptimaliseerd in vitro angiogenese-test dat de menselijke navelstreng EG en fibroblasten gebruikt. Dit model recapituleert alle van de belangrijkste vroege stadia van angiogenese en, belangrijker nog, de schepen weer te geven patent intercellulaire lumen, omringd door gepolariseerd EC. EG worden gecoat op cytodex microdragers en ingebed in een fibrine gel. Fibroblasten zijn gelaagd op de top van de gel, waar zij nodig oplosbare factoren die de bevordering van EG-ontspruit uit het oppervlak van de kralen. Na een aantal dagen, talloze schepen aanwezig zijn die gemakkelijk kunnen worden waargenomen onder fase-contrast-en time-lapse microscopie. Deze video toont de belangrijkste stappen bij het opzetten van deze culturen.
Protocol
VOORBEREIDEN CELLEN
- Brengen HUVEC en fibroblasten in M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 dagen voor de kralen.
- Schakelaar middellange tot EGM-2 (Clonetics) de dag voor beading voor HUVEC en de dag voor inbedding van fibroblasten.
- Een concentratie van ~ 400 HUVEC per kraal is nodig.
- 20.000 fibroblasten per goed is nodig.
Coaten van de parels MET HUVEC - dag-1
- Trypsinize HUVEC.
- Laat kralen om zich te vestigen (NIET CENTRIFUGE!). Zuig het supernatant en kort was de kralen in een ml warm EGM-2 medium.
- Mix 2500 kralen w / 1x10 6 HUVEC in 1,5 ml warm EGM-2 medium in een FACS buis. Verticaal plaats het in de incubator. (Dit zal genoeg zijn voor ~ 10 wells. Schaal indien nodig)
- Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C, het schudden van de buis om de 20 minuten. (Een goede coating is van cruciaal belang voor kiemen.)
- Na 4 uur, de overdracht van de gecoate parels aan een T25 kolf in 5 ml van de EGM-2 en laat O / N.
INBEDDING gecoate parels in fibrine GEL - DAG 0
- Bereid de 2,0 mg / ml fibrinogeenoplossing (zie recept sectie).
- Voeg 0,15 Eenheden / ml aprotinine aan de fibrinogeen-oplossing.
- Transfer gecoate kralen om een 15 ml conische buis en laat de kralen af te wikkelen. Resuspendeer kralen in 1 ml van de EGM-2 en transfer naar een 1,5 ml centrifuge buisje.
- Was de kralen 3X met 1 ml van EGM-2 door pipetteren op en neer LANGZAAM.
- Rekenen kralen aan een dekglaasje en resuspendeer in fibrinogeen-oplossing bij een concentratie van ~ 500 kralen / ml.
- Voeg toe 0.625 Eenheden / ml trombine aan elk putje.
- Voeg 0,5 ml van de fibrinogeen / kraal ophanging aan elk putje van een 24-well plaat.
Wijzig de pipetpunt voor elk goed! - Meng de trombine en de fibrinogeen door te gaan op en neer voorzichtig met de pipetpunt ~ 4 tot 5 keer. Wees voorzichtig om geen grote bubbels te maken.
- Laat de plaat gedurende 5 minuten in de motorkap, en plaats deze in de 37 ° C-incubator voor 10-15 minuten tot een stolsel te genereren.
- Tijdens het wachten op het stolsel, trypsinize fibroblasten.
- Voeg 1 mL van EGM-2 per well druppelsgewijs.
- Zaad fibroblasten op de top van fibrine-gel met een concentratie van 20.000 cellen per well.
OPMERKINGEN:
Meestal, wanneer de fibrine gel is gevormd, ziet u kleine luchtbelletjes in de gel. Maak je geen zorgen, zullen ze verdwijnen in 3-4 dagen.
Wijzig de media om de andere dag, dat wil zeggen, Dag 2, 4, 6, enz. ..
Op dag 3 of 4 moet je beginnen te zien kiemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er is een groeiende consensus dat de drie-dimensionale (3D) in vitro angiogenese assays een model dat veel dichter bij de werkelijke omgeving in vivo dan kan worden bereikt met behulp van 2D-culturen aan te bieden. Het is duidelijk dat een superieure 3D-systemen moet reproduceerbaar zijn, en in staat zijn om een aantal van de belangrijkste stappen van angiogenese na te bootsen. Terwijl verscheidene eerdere 3D-testen zijn ontwikkeld, veel van deze beide te gebruiken hard-to-verkrijgen van microvasculair cellen, of slechts recapituleren een deel van de etappes. In deze video, beschrijven we en het uitvoeren van een optimale in vitro angiogenese-test dat de menselijke navelstreng EG, die gemakkelijk verkrijgbaar zijn en de meest gebruikte EC in vasculair onderzoek gebruik maakt. De test, in de loop van enkele dagen, consequent reproduceert lange schepen met heldere, patent intercellulaire lumen, omringd door gepolariseerd EC. Latere stadia van de EG-vertakking en fusie van schepen (anastomose) zijn ook waargenomen. Belangrijk is dat in deze culturen de HUVEC ondergaan alle van de morfologische veranderingen die gezien met microvasculaire EG, hetzij in vivo of in vitro, inclusief kiemen, migratie, aanpassing, verspreiding, buis vorming, vertakkingen en anastomose. De genexpressie profiel van de HUVEC veranderingen, in parallel, zodat deze beter overeenkomen dat van microvasculaire EG. Tot slot presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor een in vitro angiogenese model dat recapituleert een aantal belangrijke fasen van dit proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
