Summary
本视频演示了一个协议，在体外血管生成试验，概括的血管生成的几个阶段。显示图像时间的推移，发芽，管腔形成，分支和吻合 - 血管生成的关键特征 - 。
Abstract
血管生成是一个复杂的多步骤的过程，在血管生成刺激，新船都从现有的血管创建。这些步骤包括：降解基底膜，增殖和迁移（发芽）内皮细胞到细胞外基质，成线对齐欧共体（EC），分支，管腔形成，吻合术，并形成一个新的基底膜。在体外实验中有许多已开发研究这个过程，但大多只模仿血管生成的某些阶段，形态内检测的船只往往并不像在体内的船只。早期Nehls和Drenckhahn工作的基础上，我们进行了优化，利用人脐静脉EC和成纤维细胞在体外血管生成试验。这种模式概括所有的血管生成的关键早期阶段，重要的是，船只显示极化欧共体包围专利间流明。欧共体涂到cytodex微载体，并嵌入到纤维蛋白凝胶。成纤维细胞分层他们提供必要的可溶性因子，促进欧共体从珠的表面发芽的凝胶上。几天后，无数的船只，可以很容易地相衬和时间推移显微镜下观察。本视频演示了在建立这些文化的关键步骤。
Protocol
制备细胞
- M199/10％胎牛血清/笔链球菌（1:100）前1-2天钉珠人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞。
- 开关中EGM - 2（Clonetics）一天HUVEC和一天前珠串成纤维细胞前嵌入。
- 〜400人脐静脉内皮细胞，每珠浓度是必要的。
- 20,000元以及成纤维细胞是必要的。
涂层珠与人脐静脉内皮细胞 - 天-1
- Trypsinize人脐静脉内皮细胞。
- 允许珠解决（请勿离心机！）。吸出上清液，1毫升温暖EGM - 2培养基洗珠简要。
- 混合2500珠W / 1X10 6血管内皮细胞在1.5毫升的温暖EGM - 2在流式细胞仪管媒介。孵化器在垂直的地方。 （这将是足够的〜10口井。规模，如果需要的话）
- 在37℃孵育4小时，每20分钟摇动管。 （涂好发芽的关键。）
- 4小时后，转移涂层珠，在EGM - 2毫升的T25烧瓶和离开的O / N。
嵌入纤维蛋白凝胶包被的磁珠 - 0天
- 准备2.0 mg / mL的纤维蛋白原的解决方案（见配方一节）。
- 0.15单位/毫升抑肽酶，加入纤维蛋白原的解决方案。
- 涂珠转移到15ML的锥形管，让珠定居。 1ML EGM - 2和转移到1.5ml离心管中的悬浮珠。
- 洗净珠3X EGM - 2 1ML pipeting起来，慢慢放下。
- 珠盖玻片计数和纤维蛋白原溶液重悬〜500珠/毫升的浓度。
- 添加0.625单位/ mL的凝血酶每口井。
- 每孔24孔板加入0.5毫升的纤维蛋白原/磁珠悬浮。
更改为每口井的枪头 ！ - 混合向上和向下枪头轻轻〜4至5倍的凝血酶和纤维蛋白原。要小心，不要让大的气泡。
- 板留在引擎盖5分钟，然后放置10-15分钟，以生成一个血块在37℃的孵化器。
- 在等待血块的同时，trypsinize成纤维细胞。
- 添加1毫升EGM - 2％下降明智。
- 种子成纤维细胞纤维蛋白凝胶的顶部20,000元细胞的浓度。
注意事项：
通常情况下，纤维蛋白凝胶形成时，你会看到微小的气泡，在凝胶。不要担心，他们将在3-4天消失。
更改媒体隔日，即第2天，4，6，等..
第3天或4，你应该开始看到发芽。
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Discussion
有越来越多的共识，三维（3D）在体外血管生成的实验提供了一个模型，它在体内更接近实际环境比可达到使用2D文化。很明显，优越的3D系统应重现性好，能够模仿一些血管生成的主要步骤。虽然前几届的3D检测得到了发展，其中许多可以使用难以取得微血管细胞，或仅复述一些阶段。在这个视频中，我们描述和执行在体外血管生成试验，利用人脐静脉EC，这是很容易获得和在血管研究中最常用的EC的优化。该试剂盒，在数天的过程中，一贯重现清楚，周围极化欧共体专利间流明长的船只。 EC分支和船只的融合（吻合）的后期阶段，也观察到。重要的是，在这些文化中的血管内皮细胞接受所有与微血管EC的形态学变化，无论是在体内或体外，包括发芽，迁移，对齐，增殖，管的形成，分支和吻合。基因表达谱的血管内皮细胞的变化，与此同时，更加紧密地匹配微血管EC。总之，我们目前在体外血管生成模型一个优化的协议，概括这个过程中的几个重要阶段。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
