Summary
Cette vidéo montre le protocole d'un essai angiogenèse in vitro que les stades récapitule plusieurs de l'angiogenèse. Time-lapse images de la germination, la formation de lumière, la ramification et anastomose - caractéristiques essentielles de l'angiogenèse - sont présentés.
Abstract
L'angiogenèse est un complexe multi-étapes, où, en réponse aux stimuli angiogéniques, les nouveaux navires sont créés à partir de la vascularisation existante. Ces étapes comprennent: la dégradation de la membrane basale, la prolifération et la migration (germination) des cellules endothéliales (CE) dans la matrice extracellulaire, l'alignement de la CE en cordons, de branchement, la formation de lumière, anastomose, et la formation d'une nouvelle membrane basale. Beaucoup d'essais in vitro ont été développées pour étudier ce processus, mais la plupart ne reproduisent certaines étapes de l'angiogenèse, et morphologiquement les vaisseaux dans les dosages ne sont souvent pas ressembler à des navires in vivo. Basé sur des travaux antérieurs et Nehls Drenckhahn, nous avons optimisé un dosage de l'angiogenèse in vitro qui utilise la veine ombilicale humaine CE et les fibroblastes. Ce modèle reprend toutes les étapes clés au début de l'angiogenèse et, surtout, les vaisseaux d'affichage des brevets lumens intercellulaire entouré par polarisée CE. CE sont enduites sur microporteurs Cytodex et intégrés dans un gel de fibrine. Les fibroblastes sont en couches sur le dessus du gel, où ils assurent nécessaires facteurs solubles qui favorisent la germination CE de la surface des billes. Après plusieurs jours, de nombreux navires sont actuellement qui peut facilement être observée sous contraste de phase et de la microscopie time-lapse. Cette vidéo montre les étapes clés à mettre en place ces cultures.
Protocol
CELLULES PRÉPARATION
- Amener HUVEC et des fibroblastes en M199/10% de FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 jours avant perles.
- Interrupteur à moyen et à EGM-2 (Clonetics) la veille pour le perlage HUVEC et le jour avant l'intégration des fibroblastes.
- Une concentration de ~ 400 billes par HUVEC est nécessaire.
- 20000 fibroblastes par puits est nécessaire.
REVÊTEMENT les billes avec HUVEC - Jour -1
- Trypsiniser HUVEC.
- Autoriser perles de régler (Ne pas centrifuger!). Aspirer le surnageant et laver les perles brièvement dans 1 ml d'eau tiède EGM-2 moyennes.
- Mix 2500 perles w / 1X10 6 HUVEC dans 1,5 ml d'eau tiède EGM-2 moyennes dans un tube FACS. Placez-le verticalement dans l'incubateur. (Ce sera suffisant pour ~ 10 puits. Intensifier si nécessaire)
- Incuber pendant 4 heures à 37 ° C, en agitant le tube toutes les 20 min. (Bon revêtement est cruciale pour la germination.)
- Après 4 heures, transférer l'billes revêtues d'un flacon de 5 ml de T25 dans EGM-2 et laissez O / N.
INCORPORER billes revêtues en fibrine GEL - JOUR 0
- Préparer la solution de fibrinogène 2,0 mg / ml (voir la section recette).
- Ajouter 0,15 unités / ml d'aprotinine pour la solution de fibrinogène.
- Transfert des billes revêtues d'un tube conique de 15 ml et laisser s'installer des perles. Remettre en suspension dans 1ml perles d'EGM-2 et le transfert d'un tube à centrifuger de 1,5 ml.
- Laver les billes 3X avec 1mL d'EGM-2 par pipetage et lentement.
- Nombre des perles sur une lamelle et remettre en suspension dans une solution de fibrinogène à une concentration de ~ 500 billes / mL.
- Ajouter 0.625 unités / ml de thrombine à chaque puits.
- Ajouter 0,5 mL de la suspension du fibrinogène / bille dans chaque puits d'une plaque de 24 puits.
Changer l'embout de pipette pour chaque puits! - Mélanger la thrombine et le fibrinogène en allant de haut en bas doucement avec la pipette ~ 4 à 5 fois. Soyez prudent de ne pas faire de grosses bulles.
- Laisser la plaque pendant 5 min dans la hotte, puis le placer dans le 37 ° C-incubateur pendant 10-15 min pour générer un caillot.
- En attendant que le caillot, trypsiniser fibroblastes.
- Ajouter 1 mL d'EGM-2 par puits goutte à goutte.
- Fibroblastes semences sur le dessus du gel de fibrine à une concentration de 20 000 cellules par puits.
NOTES:
Habituellement, lorsque le gel de fibrine est formé, vous pourrez voir de minuscules bulles dans le gel. Ne vous inquiétez pas, ils vont disparaître en 3-4 jours.
Changer les médias tous les autres jours, c'est à dire, Jour 2, 4, 6, etc ..
En 3 ou 4 jours, vous devriez commencer à voir germer.
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Discussion
Il ya un consensus croissant selon lequel trois dimensions (3D) dans les essais angiogenèse in vitro offrent un modèle qui est beaucoup plus proche de l'environnement réel in vivo que peut être réalisé en utilisant des cultures 2D. Il est évident que la supériorité des systèmes 3D doit être reproductible et être capable d'imiter plusieurs des grandes étapes de l'angiogenèse. Bien que plusieurs dosages précédents 3D ont été développés, beaucoup de ces soit utiliser difficiles à obtenir des cellules microvasculaires, ou seulement récapituler quelques-unes des étapes. Dans cette vidéo, nous décrivons et effectuer une analyse optimisée dans l'angiogenèse in vitro qui utilise la veine ombilicale humaine CE, qui sont faciles à obtenir et les plus couramment utilisés dans la recherche CE vasculaires. Le test, au cours de plusieurs jours, se reproduit constamment des navires de long avec claire, brevets lumens intercellulaire entouré par polarisée CE. Stades ultérieurs de la CE de branchement et la fusion des navires (anastomose) sont également observées. Fait important, dans ces cultures l'HUVEC subir toutes les modifications morphologiques qui sont vus avec microvasculaire CE, soit in vivo ou in vitro, y compris la germination, la migration, l'alignement, la formation du tube de prolifération, de branchement et l'anastomose. Le profil d'expression génique des changements HUVEC, en parallèle, pour mieux correspondre à celle de microvasculaire CE. En conclusion, nous présentons un protocole optimisé pour un modèle d'angiogenèse in vitro qui récapitule plusieurs étapes importantes de ce processus.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
